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花生（Arachis hypogaeaL.,2n=4x=40,genome AABB）是世界上重要的油料与经济作物。但花生遗传基础狭窄,种质资源匮乏。人工诱变可以有效创制基因突变和染色体变异材料,增加物种遗传多样性,是花生遗传改良的重要途径。然而,由于花生细胞学的标记少,染色体核型分辨率低,制约了花生染色体变异的有效鉴定。寡核苷酸荧光原位杂交（Oligonucleotides fluorescence insitu hybridization,Oligo-FISH）是近年来发展的一种经济高效的染色体鉴定方法,其探针可以基于基因组测序序列进行设计,为花生染色体变异的鉴定提供了新的途径。花生基因组测序的完成为寡核苷酸探针的开发提供了参考序列。本研究以花生栽培种Tifrunner和野生种的基因组序列为研究对象,采用生物信息学和细胞遗传学方法,开发串联重复序列（Tandem repeats,TR）、弥散性重复序列（Interspersed repeats,IR）、单拷贝序列和基因组特异序列寡核苷酸探针,构建花生Oligo-FISH新核型,大大提升染色体的识别能力,有助于实现染色体区段的可视化,揭示基因组间的亲缘关系等。同时利用60Co-γ辐照花生植株,创制染色体变异材料,利用Oligo-FISH新核型对变异材料进行精细鉴定。主要研究内容与结果分述如下:1.构建与基因组序列图谱对应的花生Oligo-FISH新核型。利用花生栽培种Tifrunner及其A组供体亲本Arachisduranensis和B组供体亲本Arachis ipaensis的参考基因组序列,采用生物信息学技术进行全基因组重复序列挖掘,开发了114个新的寡核苷酸探针,经验证,其在花生染色体上均有清晰且稳定的FISH信号。根据这些寡核苷酸探针的位点、带型信息,将其分成28种类型。并对28个代表性探针进行了染色体物理定位,发现8个探针定位在染色体次缢痕、臂中和末端区域,15个定位在染色体着丝粒区域,4个是B基因组特异探针,1个是B09染色体特异探针。结合带型特征,选择了 6个新开发的探针,并与前期开发的探针组配了两个探针套:Multiplex#3和Multiplex#4,其中Multiplex#3包含FAM修饰的TIF-439、TIF-185-1、TIF-134-3和TIF-165-3,Multiplex#4包含TAMRA修饰的Ipa-1162、Ipa-1137、DP-1和DP-5。利用上述探针套通过顺序FISH/GISH（Genomic in situ hybridization）和计算机电子定位技术,首次建立了与基因组序列图谱对应的花生染色体核型,为整合基因组序列信息与细胞学信息提供了依据。2.开发花生野生种特异寡核苷酸探针提升其染色体识别能力。针对缺乏参考基因组序列的野生种,对其低深度重测序片段（reads）进行了聚类分析,并与栽培种等已公布的基因组序列进行比对,从高置信度（high confidence）野生种特有的序列中设计了 1个H基因组特异探针和1个物种特异探针,为H基因组物种A.pusilla和A.dardonoi的细胞学鉴定提供了有效探针,也为其它作物近缘物种基因组特异探针的开发提供了参考。此外,还基于野生种测序数据获得了 12个非特异的寡核苷酸探针,其中4个来自A基因组物种,4个来自E基因组物种,4个来自H基因组物种,增加了野生种染色体带型的丰富性,为后续远缘杂交后代中外源染色体的鉴定提供了新的标记。3.发明高效的Oligo-GISH染色技术,揭示花生野生种与栽培种亚基因组的亲缘关系。在TR全基因组分析的基础上,开展TR阵列的聚类分析,筛选到一个重复序列簇,从中发掘出4个弥散分布于A和B亚基因组的寡核苷酸,组配寡核苷酸探针套Multiplex#A和Multiplex#B,可用于涂染和区分花生A、B亚基因组,进而建立了高效的Oligo-GISH染色技术,能够替代以A.duranensis和A.ipaensis基因组DNA为探针的GISH,极大地压缩了实验的时间和成本。利用该技术涂染14个野生种的染色体,发现A.duranensis、A.diogoi、A.herzogii、A.villosa、A.microsperma、A.simpsonii和A.duranensis-2 的基因组与花生栽培种A亚基因组的亲缘关系较近,A.ipaensis、A.valida、A.batiocoi和A.trinitensis的基因组与花生栽培种B亚基因组亲缘关系较近,A.stenophylla的基因组与花生栽培种A、B亚基因组均具有一定的同源性,A.pusilla和A.dardonoi的基因组与花生栽培种A、B亚基因组的同源性均较差,展示了该技术在分析花生（亚）基因组同源性方面的应用潜力。4.利用单拷贝寡核苷酸探针库FISH实现花生染色体区段可视化。基于花生野生种A.duranensis的参考基因组,以富含基因序列的A03和A04染色体末端为目标区域,设计了两个单拷贝寡核苷酸探针库L3A-1和L4A-1,通过Oligo-FISH实现了花生A03染色体1-8 Mb和A04染色体114-122 Mb区域的可视化。通过上述探针库与栽培种Tifrunner FISH发现,L3A-1在A01等染色体着丝粒区域能够产生杂交信号,与探针库在A.duranensis上的电子定位结果不一致。进一步将探针库L3A-1与Tifrunner基因组序列进行比对分析,从中挖掘出4条在Tifrunner基因组序列中表现为重复序列的寡核苷酸探针,经与Tifrunner和A.duranensis FISH,两个物种的染色体上均出现多处杂交信号,暗示作为单拷贝寡核苷酸探针库设计基础的A.duranensis基因组序列图可能还需要进一步的完善。5.建立一种创制和鉴定花生染色体变异的有效方法,用于培育遗传研究和育种的新材料。利用60Co-γ射线辐照四粒红盛花期植株和FISH/GISH技术,发现辐射剂量1200 rad和1600 rad均能有效诱导花生染色体变异,两种剂量辐射后植株收获的荚果数和籽粒数无显著差异,但1600 rad剂量下的染色体变异率（25.7%）高于1200 rad（24.0%）。利用该方法获得了 97粒包含易位、缺失等染色体结构变异和染色体数目变异的花生材料,促进了花生部分同源染色体和非同源染色体之间的物质交换。利用Oligo-FISH新核型分析,进一步精准鉴定了 19个四粒红易位系、缺失系,并明确了发生变异染色体的身份,为花生染色体物理作图、基因定位和育种提供了基础材料。综上所述,本研究利用基因组序列和生物信息学分析,建立了有效的花生寡核苷酸探针设计方法,为其它植物染色体标记的开发提供了参考。开发了一批有用的寡核苷酸探针,建立了高效的探针染色技术,提升了花生染色体鉴定能力,为后续高通量鉴定花生染色体变异等提供了支撑。此外,本研究还创制并鉴定了一批含有染色体变异的花生新材料,为后续花生染色体研究和育种提供了新的资源。