【摘 要】
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本文在抗菌肽Tachyplesin Ⅰ（TP Ⅰ）的分子结构特征基础上,以提高TP Ⅰ抗菌活性的同时降低其溶血性为目的,通过生物信息学软件开展设计,改变了母肽TP Ⅰ的结构参数,合成了一种新型抗菌肽TP Ⅰ-Y4,并研究了TP Ⅰ和TP Ⅰ-Y4的构效关系与抑菌机制。具体包括以下几个方面:TP Ⅰ-Y4是保持TP Ⅰ的肽链长度与电荷数不变,将形成二硫键的四个半胱氨酸用芳香族氨基酸酪氨酸替换。经过生
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本文在抗菌肽Tachyplesin Ⅰ（TP Ⅰ）的分子结构特征基础上,以提高TP Ⅰ抗菌活性的同时降低其溶血性为目的,通过生物信息学软件开展设计,改变了母肽TP Ⅰ的结构参数,合成了一种新型抗菌肽TP Ⅰ-Y4,并研究了TP Ⅰ和TP Ⅰ-Y4的构效关系与抑菌机制。具体包括以下几个方面:TP Ⅰ-Y4是保持TP Ⅰ的肽链长度与电荷数不变,将形成二硫键的四个半胱氨酸用芳香族氨基酸酪氨酸替换。经过生物信息学软件分析,作为阳离子肽TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4都没有形成跨膜区域,TP Ⅰ-Y4的热稳定性增强,亲水性增加。圆二色谱分析衍生肽在水相和疏水环境中结构均以β-折叠为主,且β-折叠含量高于TP Ⅰ。TP Ⅰ-Y4对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等细菌和白假丝酵母菌等真菌具有广谱的抑菌活性,TPⅠ-Y4对细菌的抑菌活性强于TPⅠ,对大肠杆菌、白假丝酵母菌的抑菌活性提高了4倍,对鼠伤寒沙门氏菌、鼠弗氏柠檬杆菌、枯草芽孢杆菌、英诺克李斯特菌的抑菌活性提高了2倍。TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4在10-20倍的MIC浓度下都没有溶血活性,TPⅠ-Y4在80μg/m L时才出现轻微的溶血活性。两者都能中和内毒素,并具有很强的热稳定性,盐离子耐受性强,在中性偏碱性环境下能保持较高活性,对胃蛋白酶、胰蛋白酶及碱性蛋白酶具有较强抵抗力,但不能抵抗蛋白酶K的酶解。TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4能够提高细菌表面疏水性,降低表面电负性。两个肽都能引起包裹钙黄绿素的脂质体泄露,在相同浓度下,TPⅠ-Y4引起的钙黄绿素泄漏率远远超过TPⅠ。TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4皆能将自身荧光特性残基插入疏水的脂质双分子层中,TP Ⅰ的N端可插入到磷脂双分子层中,TP Ⅰ-Y4至少是β-折叠结构的头部甚至整个分子插入脂质体的磷脂双分子层中,引起荧光强度的改变。TPⅠ/TPⅠ-Y4都能扰动大肠杆菌细胞外膜结构,使外膜渗透性增加,也能扰动大肠杆菌质膜导致通透性增加,使胞内Ca2+和K+离子泄露,TPⅠ-Y4对细胞内、外膜的扰动能力强于TP Ⅰ,其抑菌活性更强。TP Ⅰ/TP Ⅰ-Y4能够进入大肠杆菌中积累并作用于DNA的磷酸基团和嵌插到大肠杆菌基因组DNA碱基对中,TP Ⅰ能够与DNA结合但不能断裂DNA,TP Ⅰ-Y4则能结合破坏DNA的双螺旋结构。可见疏水性更高,分子柔韧性延展性更好的TP Ⅰ-Y4结合DNA碱基对的能力强于TP Ⅰ,酪氨酸的引入导致TP Ⅰ-Y4对DNA的嵌入作用更强。TP Ⅰ-Y4能在胞内与基因组DNA的碱基对和磷酸基基团结合使双螺旋结构变得松散断裂,影响细菌细胞正常代谢与生命周期进程。综上,基于TPⅠ的结构特性设计了一种毒性更小、抗菌活性更强的衍生肽TP Ⅰ-Y4,对TP Ⅰ-Y4的膜作用机制、胞内DNA作用机制进行了初步探究。TP Ⅰ和TP Ⅰ-Y4不仅能扰动细胞膜,导致渗透性增加,还能结合胞内DNA而达到抑菌目的。TP Ⅰ-Y4在提高了抑菌活性的同时降低了溶血活性,展现的质膜渗透能力更强、结合嵌入DNA的能力更强,这是它抑菌活性比TP Ⅰ强的原因。抗菌肽作用位点的多样性是其具有快速的杀菌能力以及不易产生耐药性的主要原因。芳香族氨基酸取代稳定β-折叠的半胱氨酸残基的设计方案的成功为设计具有特定β-折叠结构的抗菌肽提供了一种可行的策略。
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