论文部分内容阅读
蓝靛果（blue honeysuckle,Lonicera caerulea L.）属忍冬科植物,富含多种多酚类物质,具有抗炎、抗氧化、抗病毒、降血脂、降血糖及提高免疫力等作用。既往研究发现,蓝靛果多酚提取物对心脏、肝脏、肾脏具有保护作用,而对于肺部疾病研究较少。矽肺是由于在职业生产环境中长期吸入大量游离二氧化硅所引起,以肺部广泛结节性纤维化为主的职业性肺部疾病,其主要特征是慢性肺部炎症和进展性肺组织纤维化。目前尚未找到有效的治疗方法,因而,研究蓝靛果多酚提取物对矽尘所致肺部炎症和纤维化的调控作用及机制,为寻找潜在延缓矽肺进展的药物或功能性食品提供理论依据,具有重要意义。本研究通过建立矽肺小鼠模型和矽肺体外模型,从炎性细胞因子、细胞凋亡相关蛋白、氧化应激、抗氧化能力、MAPK及Nrf2/HO-1信号通路等多个方面,探讨蓝靛果多酚提取物抑制矽尘所致肺部炎症和纤维化的免疫调控机制。其主要研究结果如下:采用盐酸酸化乙醇溶液,根据超声波辅助法提取蓝靛果多酚,在单因素实验基础上,通过响应面分析方法优化提取工艺。根据模拟实验调整后,蓝靛果多酚的最佳提取工艺为:料液比1:25（g/m L）、提取温度40℃、乙醇体积分数55%。在此条件下进行实验,可得到蓝靛果多酚提取物的含量为8.52±0.02 mg/g。我们采用大孔树脂纯化法,分析6种大孔树脂对蓝靛果多酚的吸附及解吸效果,结果显示D101大孔树脂对蓝靛果多酚的吸附和解吸效果最佳。根据单因素实验,确定大孔树脂最适宜的动态吸附及解吸条件为:吸附平衡时间12 h、解吸平衡时间2 h、上样浓度2.6 mg/m L、乙醇浓度95%;蓝靛果多酚的动态吸附解吸优化条件为:上样流速4BV/h、上样量520 m L、洗脱流速5 BV/h。在此条件下,蓝靛果多酚粗提液经过D101大孔树脂纯化,多酚纯度由10.32%提高到72.87%。使用HPLC-ESI-MS2和HPLC法分析提取物中各组分,我们发现每毫克蓝靛果多酚提取物中含有0.41 mg矢车菊-3-葡萄糖苷和0.22 mg绿原酸,是蓝靛果多酚提取物中主要多酚成分。采用MH-S细胞系建立矽肺体外模型,给予矽尘暴露巨噬细胞不同浓度蓝靛果多酚提取物处理。细胞活力检测结果显示,所选用浓度的蓝靛果多酚提取物对MH-S细胞没有抑制作用。ELISA结果表明,蓝靛果多酚提取物可有效抑制矽尘处理巨噬细胞分泌IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1（P<0.01）。与单独矽尘处理组相比,蓝靛果多酚提取物可抑制矽尘处理组巨噬细胞中p38和JNK蛋白磷酸化（P<0.001）,而且受抑制程度与蓝靛果多酚提取物浓度呈剂量反应关系;而蓝靛果多酚提取物不影响总p38和JNK蛋白水平。与单独矽尘处理组相比,蓝靛果多酚提取物可有效减少巨噬细胞核中NF-κB的表达（P<0.0001）。流式细胞术结果显示,矽尘颗粒可诱导MH-S细胞凋亡;而蓝靛果多酚提取物可降低MH-S细胞凋亡的比例（P<0.0001）。与单独矽尘处理组相比,蓝靛果多酚提取物可减少矽尘处理组巨噬细胞中cleaved Caspase-3和Bax表达;而增加PARP和Bcl2蛋白表达（P<0.0001）。与单独矽尘处理组相比,蓝靛果多酚提取物可降低矽尘处理组巨噬细胞中i NOS表达;而升高Nrf2和HO-1蛋白表达（P<0.01）。结果表明,蓝靛果多酚提取物可通过调节巨噬细胞内氧化应激反应,激活Nrf2/HO-1信号通路,抑制MAPK信号通路活化,进而减轻矽尘颗粒所致巨噬细胞炎症反应。通过构建实验性矽肺小鼠模型,给予小鼠灌注不同浓度蓝靛果多酚提取物,探讨蓝靛果多酚提取物对矽尘所致肺部损伤的影响。HE、免疫组化及姬姆萨染色结果发现,与单纯矽尘暴露组相比,蓝靛果多酚提取物可减少矽尘所致肺部炎性细胞的聚集。与单独矽尘处理组相比,蓝靛果多酚提取物可减少小鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1含量（P<0.05）。Masson染色、q PCR及羟脯氨酸检测结果表明,蓝靛果多酚提取物可减少矽尘暴露小鼠肺部胶原蛋白沉积和纤连蛋白表达（P<0.05）。与单纯矽尘暴露组相比,蓝靛果多酚提取物可降低矽尘暴露小鼠肺门淋巴结中Th1、Th2、Th17、Tregs细胞比例（P<0.05）。Western blot结果表明,较单纯矽尘暴露组相比,蓝靛果多酚提取物可下调小鼠肺组织中p38和JNK蛋白磷酸化水平（P<0.01）,且呈剂量反应关系,而不影响总p38和JNK蛋白水平。蓝靛果多酚提取物可减少矽尘暴露小鼠肺组织中i NOS蛋白的表达（P<0.01）;而增加小鼠肺组织中Nrf2和HO-1蛋白表达（P<0.01）。结果表明,蓝靛果多酚提取物可通过调节小鼠肺组织中氧化应激反应,激活Nrf2/HO-1信号通路,抑制MAPK信号通路活化,减轻巨噬细胞及CD4+T介导的免疫反应,延缓矽尘所致肺部炎症和纤维化。