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研究背景:
耳聋肌张力障碍视神经病(Deafness Dystonia Optic Neuropathy,DDON)综合征,也被称为Mohr-Tranebjaerg综合征(MTS;MIM304700),是一种罕见的进行性X连锁隐性遗传疾病,全世界至今报导有37个家族91例DDON患者。患者主要为男性,主要的临床特征是出生后进行性加重的感音性听力损伤、逐渐加重的肌张力障碍和共济失调。DDON综合征主要的致病基因为DDP1(Deafness/Dystonia Peptide1),DDP1也被称为T/MM8A(Translocase of InnerMitochondrial Membrane8A),位于X性染色体长臂的2区2带1亚带,即Xq22.1。DDP1/TIMM8A基因编码的DDP1蛋白含97个氨基酸残基,预测分子量约11kDa,是高度保守的线粒体蛋白。DDP1在人的大脑丰富表达。由于缺乏相应的动物模型,相关的机制研究主要停留在细胞和酵母研究水平。在酵母细胞中,Tim8的突变或缺失影响酵母细胞Tim23转运,导致细胞膜电位受损及温度敏感生长特性缺失。类似现象,人DDP1酵母同源的蛋白Tim8位于线粒粒双层膜间隙内(IMS),并与Tim13形成70kDa聚合体而调节Tim23前体蛋白转位,对线粒体内膜的生物合成起重要的作用,但DDP1详细的致病机制不明确。本研究中发现一例26岁临床可疑的DDON患者存在DDP1基因的新的半合子突变(NM_004085.3):c.82C>T(p.Q28*)。为进一步研究新的变异对疾病产生的影响,采用CRISPR/Cas9技术构建模拟DDP1(p.Q28X)位点变异的基因敲入小鼠DDP/(p.I23fs49X),对该小鼠进行行为学研究,以观察该小鼠模型表型与DDON综合征的区别,并进一步研究DDON综合征的致病机制以及可能的靶向治疗。
研究目的:
1.对临床一例可疑的DDON患者进行临床诊断及分析
2.构建模拟DDP/(p.Q28X)位点变异的基因敲入小鼠DDP/(p.I23fs49X)
3.观察DDP1在DDP1+/y小鼠和DDP1I23fs49X/y基因鼠全身组织的表达分布变化
4.通过行为学检测比较DDP/(p.I23fs49X)基因鼠的表型与DDON综合征的相同点和不同点
5.观察DDP1I23fs49X/y基因鼠的形态学变化
研究方法:
1.对一例疑似耳聋肌张力障碍视神经病(DDON)综合征患者的临床诊断及遗传学分析。通过对患者疾病发展过程、表现特征的归纳总结,以及患者基因分析,为患者明确诊断。基因分析采用下一代目标基因全外显子捕获测序分析、对变异位点进行家系验证及功能预测,确定患者的致病原因。
2.运用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建DDP/(p.I23fs49X)基因鼠,PCR测序进行基因型验证。
3.实时定量PCR检测DDP1mRNA在24周龄DDP1+/y小鼠和DDP1I23fs49X/y基因鼠各组织中的表达变化。
4.行为学检测
实验动物分为雄性野生型DDP1+/y(WT-M)、雌性野生型DDP1+/+(WT-F)、DDP1I23fs49X/y(MUT-M)和DDP1I23fs49X/I23fs49X(MUT-F)四组。行为学实验如下:
4.1每周称量四组小鼠的体重并进行对比
4.2听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)实验检测4-5周龄四组小鼠听觉功能
4.3前肢抓力实验检测9-10周龄四组小鼠的肌力
4.4滚筒实验检测9-10周龄和24周龄四组小鼠的运动功能
4.5平衡木实验检测9-10周龄和24周龄四组小鼠的运动协调功能
4.6热板实验检测9-10周龄和24周龄四组小鼠痛觉感知功能
5.通过小鼠脑部MRI和脑组织的尼氏染色观察DDP1I23fs49X/y基因鼠形态学变化。
6.统计方法
本研究全部数据均采用SPSS20.0及GraphPad Prism7统计分析软件进行分析,两组间比较采用独立样本t检验和Wilcoxon-Mann-Whitney秩和检验分析;检验水准α=0.05,P<0.05有统计学意义。
研究结果:
1.依据患者疾病发展过程、表现特征以及患者基因型的检测,临床诊断一例DDON患者。
2.基因检测发现,患者存在DDP1基因(NM_004085.3):c.82C>T(p.Q28*)新的半合子突变。
3.经鼠尾基因鉴定,成功构建了模拟DDP1(p.Q28X)位点变异的基因敲入小鼠DDP1(p.I23fs49X)。
4.经QPCR检测发现DDP1mRNA在24周龄DDP1I23fs49X/y基因鼠的全身各组织的表达量均比DDP1+/y小鼠增高。
5.截止到目前为止,经过1年的观察,发现DDP1(p.I23fs49X)基因鼠生存率未见明显变化,但是体重从3周龄开始明显减轻。
6.行为学检测:
①听性脑干反应实验中,DDP1(p.I23fs49X)基因鼠的听力减退;
②前肢抓力实验中DDP1(p.I23fs49X)基因鼠肌力明显减小;
③滚筒实验中,DDP1(p.I23fs49X)基因鼠运动无改变:
④平衡木实验中,24周龄DDP1I23fs49X/y基因鼠平衡能力减退;
⑤热板实验中,9-10周龄DDP1I23fs49X/y基因鼠痛觉受损。
7.24周龄DDP1I23fs49X/y基因鼠全身各组织体积较DDP1+/y小鼠均减小,无脑萎缩等其他脑实质变化,脑内神经元结构无改变。
研究结论:
1.临床诊断一例DDON的患者
2.DDP1基因的新的变异p.Q28X是该DDON的患者的致病原因
3.DDP1(p.I23fs49X)基因鼠部分重复DDON综合征的表型
4.DDP1(p.I23fs49X)变异导致小鼠全身组织减小,但不影响24周龄DDP1I123fs49X/y基因鼠脑组织神经元的发育。
耳聋肌张力障碍视神经病(Deafness Dystonia Optic Neuropathy,DDON)综合征,也被称为Mohr-Tranebjaerg综合征(MTS;MIM304700),是一种罕见的进行性X连锁隐性遗传疾病,全世界至今报导有37个家族91例DDON患者。患者主要为男性,主要的临床特征是出生后进行性加重的感音性听力损伤、逐渐加重的肌张力障碍和共济失调。DDON综合征主要的致病基因为DDP1(Deafness/Dystonia Peptide1),DDP1也被称为T/MM8A(Translocase of InnerMitochondrial Membrane8A),位于X性染色体长臂的2区2带1亚带,即Xq22.1。DDP1/TIMM8A基因编码的DDP1蛋白含97个氨基酸残基,预测分子量约11kDa,是高度保守的线粒体蛋白。DDP1在人的大脑丰富表达。由于缺乏相应的动物模型,相关的机制研究主要停留在细胞和酵母研究水平。在酵母细胞中,Tim8的突变或缺失影响酵母细胞Tim23转运,导致细胞膜电位受损及温度敏感生长特性缺失。类似现象,人DDP1酵母同源的蛋白Tim8位于线粒粒双层膜间隙内(IMS),并与Tim13形成70kDa聚合体而调节Tim23前体蛋白转位,对线粒体内膜的生物合成起重要的作用,但DDP1详细的致病机制不明确。本研究中发现一例26岁临床可疑的DDON患者存在DDP1基因的新的半合子突变(NM_004085.3):c.82C>T(p.Q28*)。为进一步研究新的变异对疾病产生的影响,采用CRISPR/Cas9技术构建模拟DDP1(p.Q28X)位点变异的基因敲入小鼠DDP/(p.I23fs49X),对该小鼠进行行为学研究,以观察该小鼠模型表型与DDON综合征的区别,并进一步研究DDON综合征的致病机制以及可能的靶向治疗。
研究目的:
1.对临床一例可疑的DDON患者进行临床诊断及分析
2.构建模拟DDP/(p.Q28X)位点变异的基因敲入小鼠DDP/(p.I23fs49X)
3.观察DDP1在DDP1+/y小鼠和DDP1I23fs49X/y基因鼠全身组织的表达分布变化
4.通过行为学检测比较DDP/(p.I23fs49X)基因鼠的表型与DDON综合征的相同点和不同点
5.观察DDP1I23fs49X/y基因鼠的形态学变化
研究方法:
1.对一例疑似耳聋肌张力障碍视神经病(DDON)综合征患者的临床诊断及遗传学分析。通过对患者疾病发展过程、表现特征的归纳总结,以及患者基因分析,为患者明确诊断。基因分析采用下一代目标基因全外显子捕获测序分析、对变异位点进行家系验证及功能预测,确定患者的致病原因。
2.运用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建DDP/(p.I23fs49X)基因鼠,PCR测序进行基因型验证。
3.实时定量PCR检测DDP1mRNA在24周龄DDP1+/y小鼠和DDP1I23fs49X/y基因鼠各组织中的表达变化。
4.行为学检测
实验动物分为雄性野生型DDP1+/y(WT-M)、雌性野生型DDP1+/+(WT-F)、DDP1I23fs49X/y(MUT-M)和DDP1I23fs49X/I23fs49X(MUT-F)四组。行为学实验如下:
4.1每周称量四组小鼠的体重并进行对比
4.2听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)实验检测4-5周龄四组小鼠听觉功能
4.3前肢抓力实验检测9-10周龄四组小鼠的肌力
4.4滚筒实验检测9-10周龄和24周龄四组小鼠的运动功能
4.5平衡木实验检测9-10周龄和24周龄四组小鼠的运动协调功能
4.6热板实验检测9-10周龄和24周龄四组小鼠痛觉感知功能
5.通过小鼠脑部MRI和脑组织的尼氏染色观察DDP1I23fs49X/y基因鼠形态学变化。
6.统计方法
本研究全部数据均采用SPSS20.0及GraphPad Prism7统计分析软件进行分析,两组间比较采用独立样本t检验和Wilcoxon-Mann-Whitney秩和检验分析;检验水准α=0.05,P<0.05有统计学意义。
研究结果:
1.依据患者疾病发展过程、表现特征以及患者基因型的检测,临床诊断一例DDON患者。
2.基因检测发现,患者存在DDP1基因(NM_004085.3):c.82C>T(p.Q28*)新的半合子突变。
3.经鼠尾基因鉴定,成功构建了模拟DDP1(p.Q28X)位点变异的基因敲入小鼠DDP1(p.I23fs49X)。
4.经QPCR检测发现DDP1mRNA在24周龄DDP1I23fs49X/y基因鼠的全身各组织的表达量均比DDP1+/y小鼠增高。
5.截止到目前为止,经过1年的观察,发现DDP1(p.I23fs49X)基因鼠生存率未见明显变化,但是体重从3周龄开始明显减轻。
6.行为学检测:
①听性脑干反应实验中,DDP1(p.I23fs49X)基因鼠的听力减退;
②前肢抓力实验中DDP1(p.I23fs49X)基因鼠肌力明显减小;
③滚筒实验中,DDP1(p.I23fs49X)基因鼠运动无改变:
④平衡木实验中,24周龄DDP1I23fs49X/y基因鼠平衡能力减退;
⑤热板实验中,9-10周龄DDP1I23fs49X/y基因鼠痛觉受损。
7.24周龄DDP1I23fs49X/y基因鼠全身各组织体积较DDP1+/y小鼠均减小,无脑萎缩等其他脑实质变化,脑内神经元结构无改变。
研究结论:
1.临床诊断一例DDON的患者
2.DDP1基因的新的变异p.Q28X是该DDON的患者的致病原因
3.DDP1(p.I23fs49X)基因鼠部分重复DDON综合征的表型
4.DDP1(p.I23fs49X)变异导致小鼠全身组织减小,但不影响24周龄DDP1I123fs49X/y基因鼠脑组织神经元的发育。