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目的:慢性阻塞性肺病（COPD）是一种慢性、进行性发展的肺部疾病,自从新型冠状病毒在全球范围内严重传播以来,人们越来越担心像COPD这样的慢性呼吸道疾病患者很容易被感染,并且更容易因为肺功能障碍而出现严重的疾病,甚至死亡。香烟烟雾是促使COPD疾病发生发展的一个重要因素。香烟烟雾可导致慢性炎症和氧化应激,从而导致COPD患者的肺结构及功能障碍。因此,预防和揭示香烟烟雾诱导COPD发生发展的调控作用机制就尤为重要。血红素加氧酶-1（HO-1）是一种内源性的细胞保护酶,对机体氧化应激和炎症反应具有重要调节作用。HO-1的主要功能是裂解血红素,形成一氧化碳、游离铁和胆绿素。HO-1的细胞保护作用可能有几个不同的基本机制,包括将血红素降解为抗氧化剂胆红素,协调诱导铁蛋白和释放一氧化碳（发挥明显的抗炎和抗凋亡作用）。HO-1可由许多氧化剂和刺激物诱导,包括紫外线辐射、香烟烟雾和血红素/血红蛋白。以往研究表明,HO-1可以在体外和体内系统中呈现抗氧化和细胞保护功效。重要的是,HO-1作为抗氧化剂保护了香烟烟雾诱导血管损伤和肺损伤。目前,HO-1在香烟烟雾诱导的COPD中的具体作用机制尚不清楚。气道炎症是COPD的主要特征之一,与炎症细胞招募的增加有关。巨噬细胞在COPD的发病机制中通过产生炎症介质和趋化因子影响气道炎症。同时,抗氧化防御蛋白HO-1对香烟烟雾诱导的肺部炎症起着保护作用。重要的是,过表达HO-1可下调香烟烟雾诱导的气道炎症和肺上皮细胞炎症反应。由此可知,HO-1在香烟烟雾诱导COPD的炎症反应中具有显著的负调节作用,但其具体作用机制有待进一步阐述。研究方法:1第一部分:香烟烟雾暴露致大鼠COPD的体内研究雄性SPF级SD大鼠（230±20 g）购自锦州医科大学动物中心。动物实验的所有程序都遵守美国国立卫生研究院的《实验动物护理和使用指南》（第八版,2011年）,本方案得到了锦州医科大学附属第一医院的批准。所有动物在22±1℃、湿度45%-55%、12 h光照/黑暗周期的条件下自由饮用和进食。适应一周后,按照随机数字表法将所有大鼠随机分为2组（每组12只大鼠）,分别为对照组（Con）和COPD组（CS）。将COPD组大鼠放入自制的玻璃熏箱中（110 cm×86 cm×72cm）,熏箱四个侧面各留一个直径约为2 cm-3 cm的透气孔,每次点燃40支香烟,每次30分钟,每天熏烟2次持续90天,Con组大鼠暴露于室内空气中。香烟烟雾暴露结束,使用Anires2005动物肺功能分析系统检测第0.3秒用力呼气容积(FEV0.3),用力肺活量（FVC）,FEV0.3/FVC,吸气阻力（Ri）,呼气阻力（Re）和最大呼气流量（PEF）;分析两组大鼠肺泡灌洗液细胞分类差别;ELISA试剂盒和qRT-PCR检测血清和肺组织中炎症细胞因子和趋化因子的表达量;HE染色观察大鼠肺病理切片组织形态学改变。2第二部分:基于RNA-Seq技术香烟烟雾诱导大鼠COPD模型的转录组学研究取COPD组和Con组大鼠支气管肺泡灌洗液的巨噬细胞,提取总RNA进行转录组学测序筛选差异表达基因。同时,将差异基因根据GO注释结果以及官方分类和KEGG注释结果以及官方分类分别进行功能分类和生物通路分类。此外,采用qRT-PCR及western blot对筛选的差异低表达基因Hmox-1（HO-1）进行表达量验证。3第三部分:HO-1通过HIF-1α通路对香烟烟雾提取物诱导巨噬细胞炎症反应和氧化应激的调控作用将培养至对数期的RAW264.7细胞转染HO-1或HIF-1α过表达载体（HO-1 or HIF-1αvector）或空载体（vector）,再将2%香烟烟雾提取物（CSE）刺激转染后的RAW264.7细胞。即将RAW264.7细胞随机分为6组:未处理组（Untreated）、NC组、HO-1 vector组、2%CSE组、2%CSE+HO-1 vector组、2%CSE+HO-1+HIF-1αvector组。其中,CSE组采用2%CSE处理RAW264.7细胞12 h。随后,采用MTT检测RAW264.7细胞增殖活力;Western blotting检测HO-1蛋白的表达量;qRT-PCR检测RAW264.7细胞中HO-1、HIF-1α、炎症细胞因子和趋化因子的表达量;ELISA检测RAW264.7细胞中TNF-α、IL-6、IFN-γ和IL-1β的表达量;DCFH-DA探针法检测细胞活性氧（ROS）水平。4第四部分:体内实验验证HO-1对香烟烟雾诱导大鼠COPD的保护作用将购买的SD大鼠适应饲养一周后,按照随机数字表法将所有大鼠随机分为3组（每组10只大鼠）,分别为未处理照组（Con）、COPD组、Hemin（HO-1激动剂）+COPD组。其中,Hemin（HO-1激动剂）+COPD组大鼠在CS处理前30分钟腹腔注射Hemin（20μmol/kg）。随后,通过HE染色和肺气肿形态学分析Hemin对CS诱导大鼠COPD进展的保护作用。ELISA试剂盒检测血清中胆红素含量和TNF-α、IL-1β、IL-17和IL-6表达水平。qRT-PCR检测肺组织中炎症细胞因子和趋化因子的表达量。试剂盒检测肺组织中氧化应激指标（SOD、GSH和MDA）的含量。免疫组织化学和qRT-PCR检测肺组织中HO-1和HIF-1α的表达量。结果:1第一部分:香烟烟雾暴露致大鼠COPD的体内研究相比于Con组,CS组大鼠肺部支气管和肺泡壁变形,纤毛杂乱倒伏,上皮细胞大量脱落,肺泡变形、扩张融合成大囊腔,炎症细胞明显浸润,气管壁明显增厚、管腔狭窄。同时,CS组大鼠肺功能指标FEV0.3、FEV0.3/FVC和PEF均显著低于Con组。此外,CS组大鼠肺泡灌洗液中巨噬细胞、中性粒细胞和白细胞总数,血清和肺组织中促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-17）和趋化因子（MCP-1和MIP-2α）的表达量均显著高于Con组。2第二部分:基于RNA-Seq技术香烟烟雾诱导大鼠COPD模型的转录组学研究RNA-seq检测结果显示,总共有1752个基因差异表达（934个基因上调,818个基因下调）。其中,Homx-1（HO-1）为所研究基因中差异表达下调最显著的基因。同时,HO-1在CS组肺组织中的表达量显著低于Con组,提示其可能在COPD进展中发挥调控作用。此外,HO-1主要参与介导HIF-1α信号通路。3第三部分:HO-1通过HIF-1α通路对香烟烟雾提取物诱导巨噬细胞炎症反应和氧化应激的调控作用RAW264.6细胞经2%CSE处理12 h后,细胞增殖活力明显低于Untreated组。相比于Untreated组,2%CSE可显著下调RAW264.7细胞中HO-1的表达量。此外,2%CSE处理可显著上调RAW264.7细胞中促炎症细胞因子、趋化因子、ROS水平和HIF-1α的表达水平。然而,过表达HO-1显著抑制了CSE诱导RAW264.7细胞损伤,但过表达HIF-1α可明显逆转HO-1过表达,进而诱导细胞损伤。4第四部分:体内实验验证HO-1对香烟烟雾诱导大鼠COPD的保护作用Hemin处理可通过增加平均肺泡数和降低平均内衬间隔显著减轻CS诱导大鼠肺部损伤。相比于COPD组,Hemin组大鼠血清中总胆红素（TBil）和间接胆红素（IBil）含量明显增加,血清和肺组织中促炎症因子和趋化因子显著降低。同时,Hemin组肺组织中SOD活性和GSH含量明显高于COPD组,MDA含量显著降低。此外,COPD组中HO-1表达量低于Con组,HIF-1α明显增加,但Hemin处理后逆转了上述指标。结论:（1）CS暴露可引起肺气肿和肺功能下降,同时促使肺部炎症反应和氧化应激导致大鼠COPD,HO-1显著下调和HIF-1α信号通路被激活。（2）CSE可通过下调HO-1促进巨噬细胞炎症反应和氧化应激,且过表达HO-1通过进一步失活HIF-1α信号通路减轻CS诱导巨噬细胞损伤。（3）Hemin可通过减弱炎症反应和氧化应激,减缓因CS暴露导致的COPD肺功能下降。