论文部分内容阅读
[目 的]建立METH与HIV-Tat蛋白协同损伤树鼩BBB模型,从动物行为学、组织形态学和分子生物学三个不同角度观察各组树鼩给药后的差异,探讨GLUT1、GLUT3在METH与HIV-Tat蛋白协同损伤树鼩BBB中的作用及天麻素是否对两者协同损伤树鼩BBB具有干预治疗作用。[方 法]选择70只普通级健康成年雄性树鼩,随机分为对照组、实验组和天麻素干预组。对照组分别为生理盐水对照组和天麻素对照组;实验组分别为METH组、HIV-Tat蛋白组和METH+HIV-Tat蛋白组;天麻素干预组分别为低天麻素+METH+HIV-Tat蛋白组和高天麻素+METH+HIV-Tat蛋白组,每组10只树鼩建立METH与HIV-Tat蛋白协同损伤树鼩BBB模型。每天将树鼩放入实验箱中适应1小时,让其自由活动,连续适应3天,适应的第3天开始采用视频监控进行观察和上海欣软Super Maze系列动物行为分析软件跟踪记录树鼩在实验箱中的精神状况、运动状态和行为改变等相关指标。第4天开始给药并观察和记录树鼩在实验箱中的精神状况、运动状态和行为改变等相关指标,连续给药10天。天麻素对照组按照8mg/kg·day腹腔注射天麻素;生理盐水对照组按照天麻素对照组给药标准腹腔注射生理盐水;METH组按照8mg/kg·day腹腔注射METH;HIV-Tat蛋白组按照100ng/只·day尾静脉注射HIV-Tat蛋白;METH+HIV-Tat蛋白组按照100ng/只day尾静脉注射HIV-Tat蛋白后立即按8mg/kg·day腹腔注射METH;低天麻素+METH+HIV-Tat蛋白组先按10mg/kg·day腹腔注射天麻素,1h后再按METH+HIV-Tat蛋白组给药方式给药;高天麻素+METH+HIV-Tat蛋白组先按20mg/kg·day腹腔注射天麻素,1h后再按METH+HIV-Tat蛋白组给药方式给药。在最后一次给药24h后,根据实验要求进行取材,然后用酶标仪进行各组树鼩脑组织中EB及NaF含量检测,并用透射电镜观察各组树鼩脑组织纹状体超微结构变化,以及通过蛋白印迹技术来检测各组树鼩前额叶皮质中GLUT1、GLUT3以及JAM-A、Occludin和ZO-1三种紧密连接蛋白的表达情况。[结 果](1)成功建立METH与HIV-Tat蛋白协同损伤树鼩BBB模型。(2)成功建立树鼩清醒状态尾静脉注射单人操作方法:采用帆布手套套取和文件夹夹紧手套的方法固定树鼩,左手固定树鼩尾巴,右手持1ml一次性注射器注射药物。(3)尾静脉注射EB及NaF后,各对照组、实验组和天麻素干预组树鼩的脑组织颜色改变程度和脑组织中EB及NaF含量均不一致(P<0.05),实验组树鼩的脑组织颜色明显改变,脑组织中EB及NaF含量增加,且以METH+HIV-Tat蛋白组最为显著;干预组树鼩的脑组织颜色改变程度和脑组织中EB及NaF含量介于对照组和实验组之间,且低天麻素+METH+HIV-Tat组较高天麻素+METH+HIV-Tat组明显。(4)与对照组相比,各实验组和天麻素干预组树鼩脑组织纹状体超微结构发生不同程度的改变,且以METH+HIV-Tat蛋白组最为显著,表现为血管内皮细胞明显肿胀,基膜断裂,血管周围水肿严重,与微血管基底膜分离;天麻素干预组血管内皮细胞肿胀程度和血管周围水肿情况有所减弱。(5)给药数分钟后,各实验组(METH组、HIV-Tat蛋白组和METH+HIV-Tat蛋白组)和天麻素干预组(低天麻素+METH+HIV-Tat组和高天麻素+METH+HIV-Tat组)树鼩活动增加。并出现程度不同、持续时间不等的刻板行为(P<0.05),具体表现为:活动伴随反复探索,反复攀爬、跳跃,反复沿周围快速奔跑、绕圈,反复扭头、翘尾巴,反复抽搐打嗝背曲运动,反复抬头竖尾摇晃、步态不稳,反复抓嘴、自残,原地迅速甩尾旋转等;以METH+HIV-Tat蛋白组树鼩表现最为显著,METH组、低天麻素+METH+HIV-Tat组和HIV-Tat蛋白组次之,高天麻素+METH+HIV-Tat组树鼩的刻板行为较低天麻素+METH+HIV-Tat组树鼩的刻板行为弱。而对照组(生理盐水对照组和天麻素对照组)树鼩行为未见明显改变。(6)成功建立树鼩刻板行为评分标准:0分,静止不动或几乎没有活动;1分,正常活动伴随原地反复探索,无固定方向反复探索;2分,沿周围快速奔跑、绕圈,反复攀爬、跳跃;3分,反复扭头、翘尾巴,反复抽搐打嗝背曲运动;4分,反复抬头竖尾摇晃、步态不稳,反复抓嘴、自残;5分,原地迅速甩尾旋转。(7)各对照组、实验组和天麻素干预组树鼩在旷场中的静止时间、运动轨迹和运动总路程均不一致(P<0.05),对照组树鼩在旷场中的静止时间较长,运动轨迹较为清晰简洁,运动总路程较小;实验组树鼩在旷场中的静止时间较短,以绕圈为主且较为复杂,运动总路程较大,且以METH+HIV-Tat蛋白组最为显著;干预组树鼩在旷场中的静止时间、运动轨迹和运动总路程介于两者之间,且高天麻素+METH+HIV-Tat组较低天麻素+METH+HIV-Tat组静止时间长、运动轨迹较为清晰简洁、运动总路程小。(8)与首次给药前的体重相比,各实验组和天麻素干预组树鼩的体重均有不同程度的降低(P<0.05),而生理盐水对照组和天麻素对照组树鼩的体重则呈正常生长的增加。(9)与对照组相比,各实验组与天麻素干预组的JAM-A、Occludin和ZO-1三种紧密连接蛋白的表达均有不同程度的降低(P<0.05),以METH+HIV-Tat蛋白组降低最为显著;与METH+HIV-Tat蛋白组相比,天麻素干预后三种紧密连接蛋白表达有所改善,且高天麻素+METH+HIV-Tat组改善更为明显。(10)与对照组相比,各实验组与天麻素干预组的GLUT1和GLUT3的表达均有不同程度的降低(P<0.05),以METH+HIV-Tat蛋白组降低最为显著;与METH+HIV-Tat蛋白组相比,低天麻素+METH+HIV-Tat组和高天麻素+METH+HIV-Tat组树鼩脑组织前额叶皮质中GLUT1和GLUT3的表达情况均有所上升,且以高天麻素+METH+HIV-Tat组最为显著。[结 论](1)METH和HIV-Tat蛋白能协同损伤树鼩BBB,并导致树鼩行为学改变(表现为刻板行为显著增强、运动总路程显著增高、静止时间显著降低等)。(2)GLUT1、GLUT3在METH与HIV-Tat蛋白协同损伤树鼩BBB的过程中扮演重要作用。(3)天麻素对METH和HIV-Tat蛋白引起的树鼩BBB损伤具有良好的干预治疗作用。