青蒿琥酯对兔尿道成纤维细胞的生物学作用实验研究

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目的:观察青蒿琥酯(Artesunate,Art)对体外培养尿道成纤维细胞的增殖、凋亡作用以及对细胞的转化生长因子β1(Transforming growth factorβ1,TGF-β1)及基质金属蛋白酶1(Matrix metalloproteinases1,MMP-1)表达的影响。为临床应用青蒿琥酯治疗尿道瘢痕以及预防术后尿道狭窄复发提供实验依据,同时为尿道组织工程抗瘢痕治疗提供思路。方法:原代培养幼兔尿道成纤维细胞并鉴定,实验分为两组,包括空白对照组(Art 0mg/L)及实验组(Art 15,30,60,120,240mg/L)。1.使用酶标仪检测其在不同浓度下对细胞增殖的影响(cck8法);2.流式检测青蒿琥酯对细胞凋亡的影响(Annexin V-PI双染法);3.荧光定量PCR检测细胞在青蒿琥酯干预后的TGF-β1及MMP-1基因表达情况。4.Western blotting检测各组TGF-β1及MMP-1蛋白的表达量。结果:1.随着青蒿琥酯浓度的升高,细胞形态变化愈发明显,具体表现为胞浆变少,细胞出现皱缩,部分变圆。2.CCK8实验表明,在药物分别干预24h,48h后,与对照组相比,实验组OD值均随药物浓度升高而降低,且差异具有统计学意义,干预24小时后组间比较有显著差异(P<0.01)。干预48小时后除了60mg/L与120mg/L,120mg/L与240mg/L外,其余各浓度组之间对比也具有统计学差异(P<0.01)。3.流式检测结果显示:青蒿琥酯作用细胞后细胞凋亡率逐渐增加(P<0.01),呈剂量依赖性。4.经荧光定量RT-q PCR检测,TGF-β1mRNA在实验组细胞的表达随青蒿琥酯浓度的增加而降低,除40mg/L浓度组与80mg/L浓度组间对比无明显差异外,其余各浓度组之间比较,差异均有统计学意义(P<0.01);而MMP-1mRNA在实验组成纤维细胞中的表达,随着培养基中药物浓度的增加而升高,且不同浓度组间比较有显著差异(P<0.01)。5.随着青蒿琥酯浓度的升高,细胞TGF—β1蛋白的表达水平逐渐降低。各实验组与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.01)。其余各浓度组之间比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。此外青蒿琥酯还可剂量依赖式诱导MMP-1的表达。80mg/L浓度组与对照组相比其差异具有统计学意义(P<0.01),且各实验组间比较差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论:青蒿琥酯可抑制兔尿道成纤维细胞的增殖、细胞中转化生长因子-β1的表达,并诱导基质金属蛋白酶-1的表达,在一定浓度下,可以促进成纤维细胞的凋亡,它在治疗与预防尿道纤维化形成中的作用值得进一步研究。
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