溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）是一种慢性且易复发的炎症性疾病。此病变主要累及结肠以及直肠的粘膜和粘膜下层,以腹泻、腹痛、黏液血便为主要临床特征。目前其发病机制未完全阐释清楚,由于目前的治疗药物存在疗效差、副作用大且易产生耐药性等不足,因此亟需新型有效的治疗药物。研究表明,由CD4⁺T细胞介导的异常免疫反应是溃疡性结肠炎发病的主要因素,在炎症性肠病患者结肠病变部位存在大量CD4⁺T细胞的浸润和促炎细胞因子。因此,调节肠道中CD4⁺T细胞的功能至关重要。瞬时感受器电位离子通道A1（The transient receptor potential ankyrin subtype 1 protein,TRPA1）是一种非选择性的钙通道,在CD4⁺T细胞中功能性表达。前期研究表明TRPA1在神经性炎症和相关疼痛中具有非常重要的作用,TRPA1通道激动脱敏剂和抑制剂均可缓解溃疡性结肠炎动物模型的症状,其机制被认为与抑制结肠组织感觉神经元释放炎症介质及相关疼痛信号传导有关,但对CD4⁺T细胞的作用缺乏研究。本课题从CD4⁺T细胞的角度研究TRPA1激动脱敏剂异硫氰酸烯丙酯（allyl isothiocyanate,AITC）和抑制剂A967079、HC030031抗溃疡性结肠炎的免疫作用机制。研究目的:从CD4⁺T细胞的角度研究TRPA1调节剂缓解葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate,DSS）诱导小鼠溃疡性结肠炎的免疫作用机制。研究方法:采用溃疡性结肠炎动物模型研究TRPA1调节剂对DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎的改善作用;采用荧光定量PCR和Western Blot实验测定小鼠结肠和肠系膜淋巴结中不同亚型CD4⁺T细胞分泌细胞因子的mRNA和蛋白表达水平;采用CCK-8试剂盒检测TRPA1调节剂对溃疡性结肠炎小鼠脾脏CD4⁺T细胞增殖的作用;采用酶联免疫吸附试剂盒（ELISA）检测TRPA1调节剂对结肠炎小鼠脾CD4⁺T细胞分泌细胞因子的作用;采用CCK-8试剂盒和ELISA试剂盒检测TRPA1调节剂对野生型（wildtype,WT）小鼠和Trpa1^-/-小鼠脾淋巴细胞增殖和细胞因子分泌的影响;采用全细胞膜片钳技术记录AITC对稳定转染TRPA1通道的HEK-293细胞膜电流的作用。研究结果:TRPA1激动脱敏剂AITC（10 mg/kg）和抑制剂A967079（10 mg/kg）能够明显缓解DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠体重下降、结肠缩短;与模型组相比,TRPA1调节剂处理组小鼠结肠组织黏膜上皮细胞丢失和隐窝破坏程度减轻,炎细胞浸润明显减少;组织病理学评分结果显示TRPA1调节剂处理组的平均得分比DSS组明显降低;以上结果提示TRPA1激动脱敏剂AITC和抑制剂A967079具有改善DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎作用。在溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中,CD4⁺T细胞亚型（Th1、Th2、Th17和Treg）分泌的细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17A和TGF-β对结肠炎的发展具有非常重要的作用。我们接下来研究了TRPA1调节剂对上述细胞因子分泌的影响。结果表明,TRPA1调节剂明显减少了结肠炎小鼠结肠组织中IFN-γ、IL-4、IL-17A mRNA和蛋白表达水平,增加了TGF-βmRNA和蛋白表达水平。在肠系膜淋巴结中我们获得了相似的结果,TRPA1调节剂明显减少了IFN-γ、IL-4和IL-17A mRNA表达水平,增加了TGF-βmRNA的表达水平。以上结果提示TRPA1激动脱敏剂AITC和抑制剂A967079对CD4⁺T细胞分泌细胞因子具有调节作用,但因上述细胞因子并非单一来源于CD4⁺T细胞,为阐明TRPA1调节剂对CD4⁺T细胞的作用,我们使用免疫磁珠分选了溃疡性结肠炎小鼠脾CD4⁺T细胞,检测了TRPA1激动脱敏剂AITC（3、10、30μmol/L）和抑制剂A967079（10、30、100μmol/L）、HC030031（10、30、100μmol/L）对CD4⁺T细胞增殖和细胞因子分泌的影响。结果表明,上述调节剂对CD4⁺T细胞激活后的增殖具有一定的抑制作用,TRPA1调节剂能够明显抑制CD4⁺T细胞IFN-γ、IL-4和IL-17A的分泌,并对TGF-β的分泌具有一定的促进作用。考虑到化学小分子靶点的多样性,为进一步阐明TRPA1通道功能对CD4⁺T细胞的影响,我们分离了Trpa1^-/-小鼠脾淋巴细胞,检测了AITC（3、10、30μmol/L）、A967079（10、30、100μmol/L）和HC030031（10、30、100μmol/L）对细胞增殖和分泌细胞因子的影响。结果表明,上述工具药对Trpa1基因敲除淋巴细胞增殖和细胞因子分泌的作用明显减弱,提示TRPA1通道在CD4⁺T细胞的激活增殖和细胞因子分泌过程中发挥了重要的作用。最后,我们采用膜片钳技术检测了TRPA1激动脱敏剂AITC对TRPA1通道电流的影响,结果表明,AITC对TRPA1通道开始具有明显的激动作用,膜电流增加,但随后膜电流明显降低,提示AITC对TRPA1通道具有激动脱敏作用。研究结论:1.TRPA1激动脱敏剂AITC和抑制剂A967079有效缓解DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎。2.与正常组小鼠对比,DSS模型组小鼠结肠和肠系膜淋巴结IFN-γ、IL-4和IL-17A水平升高,TGF-β水平降低;TRPA1激动脱敏剂AITC和抑制剂A967079能够逆转上述变化。3.TRPA1激动脱敏剂AITC和抑制剂A967079、HC030031抑制CD4⁺T细胞分泌IFN-γ、IL-4和IL-17A,促进分泌TGF-β。4.TRPA1调节剂对溃疡性结肠炎的缓解作用主要通过作用于CD4⁺T细胞的TRPA1通道产生的。