硫是地球上第五大元素,是生物地球化学循环中的主要元素之一。对于所有生物体来说,硫都是一种重要且不可或缺的元素。硫在自然界中通常以硫化物、硫酸盐和单质硫的形式存在。硫化氢（H2S）是一种急性剧毒物质,但越来越多的研究表明H2S是继一氧化碳（CO）和一氧化氮（NO）后的第三类信号分子,参与生物体的多种生理过程。许多异养细菌可以用硫醌氧化还原酶（SQR）和过硫化物双加氧酶（PDO）来氧化H2S,简称SQR-PDO途径。另外,硫转移酶（ST）也可参与其中。SQR-PDO途径氧化H2S的具体步骤为:SQR首先将硫化物氧化成多硫化物（H2Sn,n≥2）,H2Sn自发或在ST的帮助下与谷胱甘肽（GSH）反应生成谷胱甘肽过硫化物（GSSH）,GSSH会被PDO氧化为亚硫酸盐,亚硫酸盐与GSSH自发或在ST的帮助下生成硫代硫酸盐。一直以来H2Sn被认为是SQR氧化H2S的最终产物,但是单质硫（S8）作为硫烷硫比较稳定的形式,理应包含在SQR的产物中。如果S8是SQR的产物,那么围绕S8的产生还有以下几个问题:SQR氧化H2S的过程中S8是如何形成的?S8的积累位置是什么?异养细菌产生的S8能否像自养细菌一样形成硫球?这些问题都有待研究。S8可以进入细胞,但是关于S8是如何传递的目前没有清楚的认知。S8最常见的应用是杀真菌剂,目前对于S8抗真菌机制缺乏明确的研究。GSH作为真菌中主要的还原型硫醇,在抗氧化方面发挥着重要的作用。S8进入细胞后会与GSH反应生成H2S和氧化型谷胱甘肽（GSSG）。H2S和GSSG分别会对真菌细胞会产生什么影响,这些影响如何发挥抑制真菌的作用,这些问题都有待阐明。为了回答以上问题,本文主要做了三方面工作:1.选用两种含有SQR的异养细菌:Ec（Cpsqr）（异源表达Cupriavidus pinatubonensis JMP134 中sqr 基因的Escherichia coli MG1655）和Corynebacterium vitaeruminis DSM20294,这两株菌不含有PDO并无法进一步氧化H2Sn和GSSH,通过检测它们氧化硫化物的产物,证明异养细菌SQR氧化硫化物的产物大部分是S8。使用透射电子显微镜和能谱扫描等技术,发现S8是以硫球的形式积累在细胞内,证明异养细菌也可以形成细胞内硫球。进一步探究了胞内积累硫球对异养细菌生理上的影响,发现随着硫球的产生,细菌胞内的还原型硫醇的含量会降低,氧化型硫醇的含量会升高。在体外研究了 Ec（Cpsqr）细胞膜组分氧化硫化物的过程以及GSH和S8的反应过程,发现在形成S8的过程中,H2Sn（n≥2）、GSnH（n≥2）和GSnG（n≥2）都会生成,这说明SQR消耗硫化物产生S8是一个复杂的过程,伴随着中间产物的动态变化。最终提出了异养细菌SQR氧化硫化物产生S8的模型,S8的产生有以下三种途径:（1）SQR氧化硫化物生成短链H2Sn,短链H2Sn会与胞内GSH反应生成短链GSnH,短链GSnH会进一步与GSH反应生成GSnG和H2S,生成的H2S会再次被SQR氧化,最终将胞内GSH消耗完,SQR生成的短链H2Sn可以延长至H2S9,从而自发形成S8;（2）在SQR氧化硫化物过程中生成的GSnH可以与另一个GSnH反应生成H2Sn和GSnG,H2Sn可以延长至H2S9,从而自发形成S8;（3）在SQR氧化硫化物过程中生成的GSnH可以与H2Sn反应生成长链的GS9H,从而自发形成S8。在S8形成的三条途径中H2Sn是关键的中间产物,这三条途径可以同时发生,但由于胞内GSH含量是有限的,所以第一条途径是S8生成的主要来源。S8在异养细菌胞内积累后会形成硫球。2.选择不同的细菌进行测试,证明两种S8的传递现象（S8在细菌之间传递和环境中S8从细菌胞外传递到胞内）在自然界中都是非常普遍的。通过使用滤膜分隔S8（积累S8的菌或环境中的S8）和受体菌,发现S8的传递需要与受体菌直接接触,排除了 S8转变成可溶性物质进入细菌细胞的可能性。检测积累S8细菌的细胞膜组分,发现一部分S8可以积累在细胞膜上,结合S8传递需要直接接触这一必要条件,推测S8在细菌间的传递和外界S8传递进入细菌的本质机理相同。通过基因敲除和制备脂质体,排除了S8通过已知的分子机制或蛋白辅助传递传递的可能性。还检测了 S8在脂质体中的溶解度,证明S8能溶于磷脂双分子层中。使用蔗糖密度梯度离心和透射电子显微镜观察,发现外界的S8能吸附在细菌细胞周围。进一步检测了 S8在脂多糖和肽聚糖中的溶解情况,证明S8也可以溶解进入脂多糖和肽聚糖。最终提出了 S8传递进入细菌细胞的机制:积累S8的细菌与受体菌直接接触时,或环境中的S8吸附到受体菌上时,S8可以通过溶解在细胞膜中从而进入细胞,整个过程不需要任何蛋白的辅助。3.通过测定生长曲线、最小抑菌浓度和生存能力来检测S8对三种微生物:Ecoli、Staphylococcus aureus 和Saccharomyces cerevisiae 的影响,发现 S.cerevisiae 对 S8 非常敏感。进一步检测了 S8进入S.cereveisia细胞后的产物,发现S8与胞内GSH反应生成H2S,同时也会造成GSSG的积累。分别研究了 H2S和GSSG对S.cerevisiae的影响。通过使用溶氧仪检测S.cereviaesiae代谢葡萄糖的耗氧速率,发现H2S能抑制S.cerevisiae的耗氧速率,但抑制作用可以通过去除H2S来解除,这表明H2S可以抑制S.cerevisiae的电子传递链。利用活性氧探针来检测S.cerevisiae胞内活性氧水平,证明GSSG的积累会导致活性氧含量上升,从而抑制细胞的生长。最终提出了 S8作为强氧化剂发挥抗真菌作用的机理:S8进入真菌胞内会将胞内GSH氧化为GSSG,同时产生H2S。H2S可以抑制电子传递链,从而降低了 ATP合成和葡萄糖代谢。GSSG的积累会导致真菌细胞面临氧化压力,从而抑制真菌的生长综上,本文重点研究了含有SQR的异养细菌在有氧条件下氧化H2S在胞内形成S8的过程,S8通过溶解在细胞膜中传递的机制以及S8作为强氧化剂抑制真菌生长的机制。这些研究有助于人们更好的了解微生物在自然界的硫循环中所发挥的的作用,并对于使用S8来治疗植物和动物的真菌感染具有指导意义。