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自然界中的植物多糖广泛分布。主要分为如纤维素、半纤维素和果胶等的细胞壁多糖以及如淀粉、菊粉等贮存多糖。由于植物多糖的多样化和复杂化,多种糖苷水解酶（glycosidehydrolases,GHs）共同参与了其降解。纤维素酶、淀粉酶等糖苷水解酶,其编码基因的表达主要在转录水平受控。其中,基因特异性的转录因子在调控GHs编码基因的转录中起关键作用。本文以两个重要的高产纤维素酶的丝状真菌草酸青霉（Penicilliumoxalicum）和里氏木霉（Trichoderma reesei）为研究对象,对调控纤维素酶编码基因的转录因子CreA/CRE1,以及调控淀粉酶编码基因的转录因子AmyR的调控机制进行了研究。此外,还研究了草酸青霉S-腺苷甲硫氨酸合成酶的生物学功能。该研究有助于深入解析丝状真菌GHs合成的调控网络,并为更深入挖掘菌株改造的潜在分子靶点提供理论依据。本论文主要研究内容如下:1.转录因子CreA/CRE1抑制纤维素酶编码基因表达的机制研究丝状真菌中,纤维素降解酶的产生需要从碳分解代谢物抑制/阻遏（carboncatabolite repression,CCR）中释放。推测转录因子 CreA/CRE1（catabolite responsive element,CRE）可能通过与辅抑制因子（corepressor）复合物参与CCR,但这种机制在丝状真菌中尚未得到证实。蛋白质串联亲和纯化TAP（tandem affinity purification）结合质谱（TAP-MS）分析和双分子荧光互补BiFC（bimolecular fluorescence complementation）表明,里氏木霉和草酸青霉中,转录因子CreA/CRE1与辅抑制因子Tup1-Cyc8复合物在细胞核内具有直接的相互作用。此结果证实了丝状真菌研究界长期以来关于CreA/CRE1介导CCR的猜想,即CreA/CRE1通过与辅阻遏复合物Tup1-Cyc8相互作用参与CCR,抑制基因表达。草酸青霉中PoCyc8作为PoTup1-Cyc8复合物的亚基,还同时与执行组蛋白H3上第36位赖氨酸（H3K36）甲基化的甲基转移酶PoSet2相互作用,表明PoTup1-Cyc8复合物作为桥梁介导了转录因子与组蛋白修饰的联系。ChIP-qPCR表明在主要纤维素酶基因（纤维二糖水解酶编码基因cbh1/cel7A和内切葡聚糖酶编码基因eg1/cel7B）启动子中的H3K36二甲基化水平与PoCreA的表达水平呈正相关。由于H3K36的甲基化是纤维素酶基因表达的抑制标志,因此提出了 PoCreA-Tup1-Cyc8-Set2介导的纤维素酶基因转录抑制的调控模型。2.草酸青霉S-腺苷甲硫氨酸合成酶PoSasA的功能研究对CreA/CRE1的转录调控研究以及越来越多的报道显示组蛋白甲基化也参与GHs编码基因的表达。S-腺苷甲硫氨酸SAM（S-Adenosylmethionine）是各种代谢过程中甲基化反应的甲基供体,且SAM仅由SAM合成酶合成。因此,进一步对其进行了相关研究。在草酸青霉中鉴定到了唯一的SAM合成酶PoSasA。PoSasA广泛分布于不同生长阶段的菌丝体中,表明了其功能的广泛性。这也解释了仅能获得含有PoSasA蛋白的异核体HKsasA,却无法成功构建PoSasA的完全缺失突变体的原因。结果显示PoSasA的缺失对于草酸青霉是致命的。HKsasA中,由于PosasA基因表达的降低,主要纤维素酶基因cbh1、eg1和木聚糖酶基因xyn10A的表达水平显著下调,同时伴随胞外纤维素酶和半纤维素酶分泌的大幅度降低。相反,PosasA的过表达提高了胞外纤维素酶和半纤维素酶的产生。使用TAP-MS鉴定了 133个与PoSasA具有相互作用的蛋白,这些蛋白的功能主要与“ATP结合”和“ATP合成酶活性”有关,还鉴定到了四种甲基转移酶。这些结果与SAM合成酶的本质特征一致。该研究揭示了草酸青霉SAM合成酶PoSasA的基本生物学功能。3.转录因子PoAmyR调控淀粉酶基因表达的机制研究淀粉酶是重要的GHs。一般认为,淀粉酶基因的转录由转录因子AmyR（amylolytic genesregulator）激活。草酸青霉中,转录因子PoAmyR负责激活淀粉酶基因的转录,但是其如何实现调控转录的确切机制仍然未知。本研究通过TAP-MS以及BiFC技术鉴定到了 PoAmyR的主要互作蛋白—组蛋白乙酰转移酶PoHat1-Hat2复合物。PoAmyR与PoHat1-Hat2的相互作用定位于细胞核内。研究显示,PoHat1亚基对淀粉酶基因Poamy13A和Poamy15A的转录和合成起负调控作用:相较出发菌株,PoHat1亚基的缺失突变体（△hat1）的Poamy13A和Poamy15A的转录水平分别增加了 10.09（±0.24）倍和8.55（±1.27）倍,淀粉酶合成和分泌显著增加;Pohat1基因的过表达菌株（OEhat1）中的Poamy13A和Poamy15A的转录水平则显著下调,淀粉酶合成和分泌降低。Western blot结果显示△hat1突变体的组蛋白H4上第12位赖氨酸（H4K12）的乙酰化水平完全消失,表明PoHat1是草酸青霉执行H4K12乙酰化（H4K12Ac）的唯一修饰酶。ChIP-qPCR结果证实,PoHat1被PoAmyR招募到靶基因的启动子特定区域,执行H4K12Ac,抑制下游淀粉酶基因的表达。结果显示,转录辅因子PoHat1-Hat2与转录因子PoAmyR之间的相互作用为调节淀粉酶基因表达提供了分子制动。以往的研究报道,Hat1通常与DNA复制和修复过程中的组蛋白沉积和染色质组装相关,而不是与转录调控功能相关。Hat1似乎是与众多组蛋白乙酰转移酶（KATs）家族成员在功能上都不同的一个特殊成员。该结果是Hat1-Hat2复合物通过基因特异性的转录因子结合靶向启动子的首次报道,也帮助Hat1回归经典KATs家族,即具有转录调控相关功能。