链霉菌是一类广泛存在于自然环境中的革兰氏阳性丝状菌,具有复杂的生命周期,在细胞发育过程中存在多种形态,例如孢子、营养菌丝体、气生菌丝体和孢子链等。在特定生长阶段链霉菌合成包括抗生素、抗真菌药、抗肿瘤药物、除草剂和杀虫剂等具有不同功能的次级代谢物,广泛应用于医疗、农业和工业等诸多领域。对于链霉菌本身来说,次级代谢物还能作为信号分子,以便在复杂环境中获得生存优势。随着测序技术的快速发展,在放线菌的基因组中挖掘了大量次级代谢物的生物合成基因簇,受到了广泛关注。次级代谢物（特别是抗生素）合成的调控一直是链霉菌代谢研究的重点关注领域,放线菌次级代谢物生物合成的分子机制已部分为人所知。在链霉菌模式菌株-天蓝色链霉菌中,一些遗传因子包括sigma因子、信号转导系统、不同家族的转录调控因子和其他DNA结合蛋白都具有调控次级代谢物生物合成的作用。这些调控因子可能是途径特异性调控因子、多效性调控因子或全局调控因子。而途径特异性调控因子往往也是其他类型调控因子发挥作用的媒介。尽管初级代谢对于次级代谢产物的前体供应非常重要,但我们对初级代谢调控的了解却十分有限。本论文主要对链霉菌保守调控因子MtrA的全局调控机制进行了深入研究,解析了 MtrA在初级代谢（碳、氮、磷）以及次级代谢中的调控功能,丰富了链霉菌分化发育、初级代谢和次级代谢的调控网络。主要的研究内容如下:本课题组之前的研究表明,MtrA是链霉菌分化发育的关键调控因子,通过调控与气生菌丝和孢子产生相关基因的表达影响菌体发育。前期转录组分析表明,与M145相比,在ΔmtrA中很多初级代谢和次级代谢相关基因的表达也发生了显著变化,提示MtrA在链霉菌多种生理过程中扮演了重要角色。（1）MtrA与GlnR竞争调控氮代谢的机制研究。在链霉菌中GlnR是一种氮代谢激活因子,在氮限制条件下激活氮同化基因。然而,在氮丰富条件下氮代谢基因的调控机制一直不清楚。我们通过基因表达分析确定MtrA在丰富培养条件下抑制氮同化基因的表达,并且与GlnR竞争结合GlnR盒（GlnR识别序列）。凝胶迁移实验（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）分析表明,在体外条件下,多个氮基因（如amtB、glnⅡ、ureA、nirB等）的GlnR盒也是MtrA的结合位点（MtrA site）,染色质免疫共沉淀和定量 PCR 联用（chromatin immunoprecipitation-quantitative PCR,ChIP-qPCR）分析表明,在体内条件下,它们也是MtrA靶位点。比较转录分析表明,在营养丰富的R2YE培养基上,MtrA显著抑制氮相关基因的表达,而在氮限制的N-Evans培养基上,GlnR明显激活氮基因的表达,表明MtrA和GlnR分别在不同氮供给条件下调控氮代谢。体外（EMSA和DNase 1 footprinting实验）及体内（ChIP-qPCR）分析表明glnR本身也是MtrA的直接靶标,而且在营养丰富条件下MtrA抑制glnR的表达。生物信息学分析揭示了mtrA和glnR在放线菌中的广泛存在。通过序列比对,在结核分枝杆菌和谷氨酸棒状杆菌的氮代谢基因上也预测到潜在的MtrA位点/GlnR盒。而且在体外的条件下,MtrA同源蛋白与这些预测的MtrA位点/GlnR盒结合,表明在放线菌中MtrA识别氮基因GlnR盒具有功能保守性。因此,在放线菌中可能普遍存在MtrA和GlnR竞争调控氮代谢基因的机制。为了分析MtrA和GlnR对氮代谢基因的综合影响,我们在链霉菌的另一种模式菌株-委内瑞拉链霉菌中构建了mtrA和glnR的双敲菌株（ΔmtrA-glnR）,进而比较了在双敲菌株（ΔmtrA-glnR）和单敲菌株mtrA（ΔmtrASVE）或glnR（ΔglnRSVE）中氮代谢基因的表达水平。在氮限制和营养丰富的条件下,氮代谢基因在ΔmtrA-glnR中的表达趋势与ΔglnRSVE相似,但与ΔmtrASVEE明显不同,说明GlnR在控制氮代谢基因中起决定性作用。同时,转录分析表明MtrA对氮代谢基因的调节依赖于GlnR。EMSA结果显示,至少在两种亲缘关系非常远的链霉菌中,MtrA和GlnR都识别氮代谢基因上游相同的结合位点。在营养丰富的条件下,MtrA在体内与这些位点的结合更强;而在氮限制条件下,GlnR在体内与之结合更强。此外,我们发现委内瑞拉链霉菌中mtrA和glnR都是自我调节的,在富氮和寡氮条件下,它们自我调控的幅度差异很大。这些结果说明链霉菌通过MtrA和GlnR的相互调控和自我调控实现对氮源的高效合理利用,为链霉菌氮代谢基因的调控提供了新的认识。（2）不同磷条件下MtrA和PhoP协同调控磷代谢的机制研究。已知链霉菌和一些其他的细菌中磷代谢主要受双组份信号转导系统PhoPR的调控。前期转录组分析表明部分磷代谢基因的表达在ΔmtrA中发生了变化,提示MtrA可能调控磷代谢。基因表达定量（Realtime PCR）分析表明,在含有低或高浓度无机磷的特定培养基上、或在不添加无机磷的复杂培养基上,MtrA不仅调控磷代谢基因（如phoA、phoD、glpQ1和pstS等）的表达,而且也调控磷代谢主要调控基因phoP的表达。在体内和体外条件下MtrA都结合磷代谢相关基因上预测的MtrA位点,表明这些磷代谢基因和磷代谢调控基因phoP都是MtrA的靶基因。同时,我们的分析表明在不同磷条件下,mtrA、phoP和glnR之间存在交互调控。而MtrA对phoPR的调控作用取决于生长条件及生长阶段,特别是在富营养条件下,MtrA抑制氮代谢基因,同时激活磷代谢基因,维持细胞内的氮磷平衡;PhoP抑制mtrA;GlnR对phoPR和磷代谢的影响是条件依赖性的。我们进一步分析了MtrA在变铅青链霉菌和委内瑞拉链霉菌中对磷代谢基因的调控作用。另外,谷氨酸棒杆菌的MtrA结合多个磷代谢基因上游预测的MtrA位点,说明在谷氨酸棒杆菌中MtrA也调控磷代谢。总之,研究表明MtrA是链霉菌及其他放线菌中磷代谢的调控因子,提示MtrA控制细胞内氮和磷的代谢流量。（3）MtrA调控碳代谢的机制研究。我们此前对碳代谢的认识主要来源于对以大肠杆菌为模型的研究,而对放线菌的碳代谢知之甚少。链霉菌的碳代谢与大肠杆菌的碳代谢有很大的不同,我们的研究表明MtrA可能具有调控碳代谢的作用。在天蓝色链霉菌中,MtrA的缺失导致培养基pH下降。靶向代谢组学定量分析表明,在ΔmtrA中,多种有机酸的水平增高。转录组分析表明相关碳代谢基因的转录发生了变化,表明MtrA的缺失导致碳代谢途径中相关酶表达异常进而造成有机酸的积累。然而,碳代谢调控是非常复杂的,过量的有机酸也会抑制或激活其他的代谢通路,造成了在ΔmtrA中碳代谢相关基因的表达不会呈现单一的模式。通过Realtime PCR分析,发现MtrA对碳代谢基因（如柠檬酸合成酶）的调控也存在生长依赖性。这些数据提示了 MtrA调控碳代谢的复杂性。通过序列比对,在多个碳代谢基因的启动子上都预测到了潜在的MtrA位点。在体外,MtrA结合部分碳代谢基因上预测的MtrA位点。此外,在多个链霉菌中MtrA的突变都会造成培养基的pH下降,提示MtrA在链霉菌属中调控碳代谢的保守性。总之,MtrA是链霉菌中一个新的碳代谢调控因子。（4）MtrA介导的次级代谢物生物合成调控机制研究。在链霉菌中抗生素生物合成的调控十分复杂。我们的研究表明MtrA是链霉菌中影响抗生素合成的一个主要调控因子。天蓝色链霉菌中MtrA的缺失影响放线紫红素（ACT）、十一烷基灵菌红素（RED）、钙依赖性抗生素（CDA）和黄色Ⅰ型聚酮化合物（yCPK）的产量,并且相关生物合成基因簇（如act、red、cda和cpk）的表达也都发生了改变。综合体外和体内分析,我们定位了 cdaR、actⅡ-orf4和redZ以及cpkA和cpkD之间的MtrA位点。在委内瑞拉链霉菌中,MtrA的缺失导致了氯霉素和杰多霉素的产素水平改变,同时相应的生物合成基因簇（分别为cml和jad）的表达也都发生了变化。在cml和jad基因簇中鉴定了 MtrA位点。至少在体外条件下,MtrA结合阿维菌素、寡霉素和井岗霉素生物合成基因簇上预测的MtrA位点,提示MtrA在阿维链霉菌和吸水链霉菌中也可能调控抗生素的合成。虽然GlnR与MtrA竞争结合部分MtrA位点,但GlnR对抗生素生物合成的作用不如MtrA显著。通过生物信息学分析,在链霉菌属和其他放线菌的多个抗生素生物合成基因簇中发现了很多潜在的MtrA位点。表明MtrA在链霉菌和其他放线菌的抗生素生物合成过程中具有普遍的调控作用。综上所述,MtrA在链霉菌乃至放线菌中是一个全局调控因子,是一个调控分化发育、初级代谢和次级代谢的关键“枢纽”。本研究拓展了我们对链霉菌初级代谢和次级代谢调控机制的认识,为后续合成生物学和代谢工程改造链霉菌提高次级代谢物的产量提供一定的理论依据。