【摘 要】
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背景和目的:动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是一种以胆固醇等脂质代谢障碍为病变基础的慢性复杂疾病。如今,AS已成为威胁人类健康最重要的疾病之一。尽管AS发病机制复杂,但血脂代谢异常,尤其是高胆固醇血症是促进AS发病的主要危险因素。研究表明,氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,ox-LDL）能通过诱导细胞内胆固醇代谢失衡、泡沫细胞
【基金项目】
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国家自然科学基金（81871701,81572051,81772244）； 广东省自然科学基金（2017A03031355,2017A030313532,2018A030313533）； 广州市科技计划（201607010267,201604020015,201707010034,201707010156）；
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背景和目的:动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是一种以胆固醇等脂质代谢障碍为病变基础的慢性复杂疾病。如今,AS已成为威胁人类健康最重要的疾病之一。尽管AS发病机制复杂,但血脂代谢异常,尤其是高胆固醇血症是促进AS发病的主要危险因素。研究表明,氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,ox-LDL）能通过诱导细胞内胆固醇代谢失衡、泡沫细胞形成进而影响AS发生;长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）在介导ox-LDL影响胆固醇代谢平衡及AS发展过程中可能发挥重要作用。本研究前期成果发现AS斑块组织中脂肪酸结合蛋白-5（fatty acid binding protein 5,FABP5）的表达显著上升,提示其很可能参与AS进程。因此,本研究旨在探讨FABP5在AS发生发展中的作用及有关机制,观察ox-LDL是否通过lncRNA或FABP5等途径影响胆固醇代谢平衡,从而促进AS发展,为进一步揭示AS胆固醇代谢障碍的具体致病机制以及寻找防治AS的新靶点提供科学依据。方法:1、采用不同浓度ox-LDL处理人主动脉平滑肌细胞（Human Aortic Smooth Muscle Cells,HASMC）,简称SMC,以及人THP-1单核-巨噬细胞,简称THP-1巨噬细胞。经实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）检测细胞中 lncRNARP11-363E6.3 的表达;经 qRT-PCR 及蛋白印迹（Western Blot）检测细胞中FABP5的mRNA及蛋白表达。2、采用CRISPR-Cas9技术构建FABP5基因敲除载体,采用RNAi技术及特异性质粒构建FABP5干扰/过表达载体,将其分别转染SMC（敲除/过表达载体）及THP-1巨噬细胞（干扰/过表达载体）,经qRT-PCR及Western Blot检测细胞中胆固醇代谢相关基因的mRNA及蛋白表达,通过细胞内胆固醇含量及流出率检测试剂盒测定细胞中的胆固醇含量及流出率。3、采用特异性质粒构建lncRNA RP11-363E6.3过表达载体,采用RNAi技术构建ABCG1干扰载体,将载体转染SMC及THP-1细胞巨噬,经qRT-PCR及Western Blot检测细胞中FABP5的mRNA/蛋白表达,通过试剂盒测定细胞中胆固醇含量及流出率。4、收集临床AS患者、糖尿病患者、AS合并糖尿病患者及健康人的血液样本,经酶联免疫吸附实验（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA）检测其血清中FABP5的表达水平,结合临床病例分析FABP5与传统血脂指标间的相关性,评估FABP5对AS的诊断价值。结果:1、FABP5介导ox-LDL抑制ABCG1表达并促进细胞内胆固醇代谢障碍。Ox-LDL可呈浓度依赖性地上调SMC及THP-1细胞巨噬中FABP5的表达;过表达FABP5能下调细胞中ABCG1的表达,促进ox-LDL抑制ABCG1表达及细胞内胆固醇外流,促进细胞内胆固醇蓄积。而敲除/干扰FABP5后可得到相反结果。2、LncRNARP11-363E6.3介导ox-LDL刺激FABP5表达并促进细胞内胆固醇代谢障碍。Ox-LDL可呈浓度依赖性地上调SMC及THP-1巨噬细胞中lncRNA RP11-363E6.3的表达;过表达lncRNARP11-363E6.3能上调细胞中FABP5的表达,促进ox-LDL刺激FABP5表达并抑制细胞内胆固醇外流,促进细胞内胆固醇蓄积。3、FABP5通过影响ABCG1表达促进细胞内胆固醇代谢障碍。在过表达FABP5的基础上干扰ABCG1表达能进一步促进SMC及THP-1巨噬细胞中胆固醇积蓄,加重细胞内胆固醇外流受阻。而在敲除/干扰FABP5的基础上抑制ABCG1表达则能逆转沉默FABP5后促进细胞内胆固醇流出,减少胆固醇聚集的效应。4、FABP5在AS患者血清中显著高表达,对AS具有诊断价值。经ELISA检测发现,AS患者血清FABP5水平显著高于正常人,且血清FABP5水平与TG成正相关,与HDL呈负相关,分析临床病例发现血清FABP5水平随AS血管狭窄程度加重而升高,ROC曲线分析显示FABP5用于诊断AS的曲线下面积达0.908。结论:1、FABP5能介导ox-LDL抑制ABCG1表达并促进细胞内胆固醇代谢障碍。2、LncRNARP11-363E6.3能介导ox-LDL刺激FABP5表达并导致细胞内胆固醇代谢失衡。3、Ox-LDL 通过 lncRNA RP11-363E6.3/FABP5/ABCG1 途径影响细胞内胆固醇代谢平衡。4、FABP5对AS具有较高诊断价值,且能在一定程度上反应AS血管狭窄程度,是AS的潜在诊断标志物。
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