【摘 要】
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目的CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)在肺发育中必不可少,可以促进肺分化成熟,其在肺中主要表达于肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)中。小泛素相关修饰物(SUMO)修饰作为一种重要的蛋白翻译后修饰方法,能够调节转录因子活性、蛋白的亚细胞定位及参与DNA损伤修复的过程。哺乳动物中,发现有SUMO1、SUMO2/3、SUMO4四种SUMO亚型,其中,SUMO1主要以与其他化合物结合的形式存在,SUMO
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目的CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)在肺发育中必不可少,可以促进肺分化成熟,其在肺中主要表达于肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)中。小泛素相关修饰物(SUMO)修饰作为一种重要的蛋白翻译后修饰方法,能够调节转录因子活性、蛋白的亚细胞定位及参与DNA损伤修复的过程。哺乳动物中,发现有SUMO1、SUMO2/3、SUMO4四种SUMO亚型,其中,SUMO1主要以与其他化合物结合的形式存在,SUMO2/3主要以游离的形式存在。本研究首先明确在人AECⅡ中,C/EBPα能否被SUMO1修饰,并鉴定其修饰位点,进一步研究SUMO1修饰C/EBPa对AECⅡ增殖及分化的影响。方法(1)采用免疫荧光双标法检测C/EBPα和SUMO1在人AECⅡ中的共定位表达情况。(2)免疫共沉淀(Co-IP)法检测C/EBPα和SUMO1在AECⅡ中的相互作用,明确人AECⅡ中C/EBPα能否被SUMO1修饰。(3)利用SUMOsp 2.0软件预测人C/EBPα被SUMO1修饰的作用位点为C/EBPα上第161位赖氨酸(即K161)。构建野生型GFP-C/EBPα质粒、突变型GFP-C/EBPα-K16IR(第161位赖氨酸突变为精氨酸)质粒,利用Lipofectamine2000脂质体转染AECⅡ,分别将野生型GFP-C/EBPα质粒及突变型GFP-C/EBPα-K16IR质粒分别转入AECⅡ中,CO-IP法鉴定C/EBPα的SUMO1修饰位点。(4)利用Lipofectamine2000脂质体转染AECⅡ,将野生型C/EBPα质粒、突变型C/EBPα-K16IR质粒及pcDNA3.1空载体分别转入AECⅡ细胞中,将细胞分为野生型-C/EBPα组、突变型C/EBPα组及空载体组。转染24 h后收集各组细胞,提取总蛋白,流式细胞术检测AQP5,以标记AQP5的阳性细胞代表AECI,检测AECⅡ的分化情况,CCK-8法检测细胞増殖情况。结果(1)免疫荧光双标发现,AECⅡ中SUMO1和C/EBPα存在共定位现象,且主要定位于细胞核中。C/EBPα和SUMO1的CO-IP结果能显示出C/EBPα-SUMO1相互作用条带,提示C/EBPα能与SUMO1相互作用。野生型GFP-C/EBPα转染的AECⅡ中,可检测到GFP-C/EBPα-SUMO1特异性条带;而突变型GFP-C/EBPα转染的AECⅡ中,不能检测到GFP-C/EBPα-SUMO特异性条带,提示C/EBPα的SUMO化修饰位点为C/EBPα第161位赖氨酸。(2)与对照组相比,转染野生型C/EBPα组及转染突变型C/EBPα-K161R组,AQP5+百分比均增高,而与转染野生型C/EBPα组相比,转染C/EBPα-K161R突变型组AQP5+百分比明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,转染野生型C/EBPα组及转染突变型C/EBPα-K161R组细胞增殖指数CCK-8均降低,而与转染野生型C/EBPα组相比,AECⅡ转染C/EBPα-K161R突变型质粒后细胞增殖指数CCK-8明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论(1)人AECⅡ中C/EBPα能被SUMO1修饰且其修饰位点为C/EBPα第161位赖氨酸。(2)SUMO1修饰可能对C/EBPα介导的AECⅡ增殖及分化过程起负性调节作用。
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