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白内障是世界范围内的主要致盲原因,目前还没有药物或者营养性的治疗可以消除已经存在的白内障或者延缓其进展,通过手术摘除白内障是主要的治疗方法.但由于植入人工晶体后失去调节能力以及存在发生后发性白内障(after cataract,或称为后囊膜混浊,posterior capsular opacification,PCO)和眼内炎症反应的可能,等等问题的出现,都在一定程度上影响了治疗的效果<[1]>.更需要指出的是,发生PCO和需要行二次激光手术的患者主要是年轻人,尤其是儿童<[2]>,以及糖尿病性视网膜病变<[3]>或者外伤性白内障<[4]>的患者.因此,研究明确白内障以及后发性白内障的发病机理,从而寻求更为安全有效的非手术的防治方法是非常重要的.
前期的研究都说明,TGF-β<,2>在诱导前囊膜下白内障形成和促进后发性白内障形成过程中发挥着重要作用.随着TGF-β<,2>对晶状体作用的研究不断深入,TGF-β<,2>发挥作用的机理受到广泛的重视和研究,本课题主要从研究TGF-β诱导晶状体上皮细胞凋亡的机理入手,发现和分析了活性氧在该过程中发挥的重要调控作用;在此研究的同时,我们发现TGF-β<,2>处理后,仍有大部分晶状体上皮细胞没有发生凋亡,表现出对TGF-β<,2>处理的耐受并发生明显的侵袭,我们对这一现象进行了分析后发现,整合素β<,1>及其介导的蛋白激酶通路在该过程中作用明显.在总结了以往关于TGF-β与白内障相关性研究的基础上,本研究就TGF-β<,2>对晶状体在各种生理病理状态下的影响进行了分析,对于全面阐明该细胞因子对晶状体的作用和作用机理做出了积极的工作.
第一部分 转化生长因子β2诱导的人晶状体上皮细胞凋亡—— 活性氧的调节作用
[研究目的]：研究发现,转化生长因子β<,2>(transforming growth factorβ<,2>TGF.β<,2>)能够抑制人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLECs)的增殖并诱导细胞发生凋亡,该过程与晶状体前囊膜下浑浊密切相关,但是这两种过程中的信号传导机制仍不明了.活性氧(reactive oxygen species,ROS)作为细胞内重要的信号传导分子参与了众多的细胞损伤过程,因此,我们的本部分的研究目的是研究ROS在TGF-β<,2>对HLECs的损伤过程中的作用,进而明确TGF-β<,2>对HIJECs的损伤机制.
[研究方法]：
体外培养的人晶状体上皮细胞株HLEB-3,用不同浓度的TGF-β<,2>处理后,分别采用MTT和nJNEL法分析TGF-β<,2>对细胞增殖和凋亡的影响.应用荧光染料DCFHDA,测定细胞内活性氧的含量改变;并且,我们测定了细胞还原型谷胱甘肽(GSH)的含量以及采用实时荧光定量RT-PCR法测定了c-fos基因的mRNA含量的变化.最后,我们通过应用不同的活性氧清除剂,抑制细胞内活性氧的升高,测定对TGF-β<,2>诱导细胞增殖和凋亡两个过程的影响.
[研究结果]：
TGF-β<,2>是晶状体上皮细胞重要的生长调节因子,并且可以引起细胞的凋亡.量效研究发现100 pg/ml TGF-β<,2>将引起细胞凋亡,而10 pg/mlTGF-β<,2>即可抑制细胞的增殖.在100pg/mlTGFβ<,2>引起HLECs凋亡的早期发现细胞内ROS含量明显增高,并且降低了细胞内GSH含量,说明TGβ<,2>可以引起对HLECs的氧化性损伤.我们同时在研究c-fos这一受氧化状态调节的重要基因的.mRNA表达中发现,只有高浓度的TGF-β<,2>(100 pg/m1)可以引起该基因的表达增高,其表达的变化情况和细胞经过氧化氢处理后的情况相似.最后,应用活性氧清除剂可以明显降低甚至阻止细胞发生凋亡,但是不能改善细胞增殖受抑制的状态.
[研究结论]：
TGF-β<,2>能够明显抑制HLECs的增殖;并在达到一定浓度后诱导HLECs发生凋亡.ROS参与了TGF-β<,2>诱导凋亡的过程.
第二部分 转化生长因子β<,2>诱导的人晶状体上皮细胞移行和粘附--整合素β<,1>及其相关的蛋白激酶通路的作用
[研究目的]：
在第一部分内容的基础上我们发现,TGF-β<,2>处理后,仍有大部分晶状体上皮细胞没有发生凋亡,表现出对TGF-β<,2>处理的耐受并出现出一定的侵袭现象.结合目前的其他研究的结果,白内障囊外摘除术后残留的晶状体上皮细胞是形成后发性白内障的重要原因,TGF-β<,2>也是参与该过程并起重要调节作用的细胞因子之一.因此,本部分的研究在第一部分的基础上,进一步发现了TGF-β<,2>对HELCs粘附和移行能力的影响,重点研究整合素β<,1>,这一在调节细胞粘附和移行方面重要的细胞表面分子的作用,以及整合素相关的粘着斑激酶 (focal adhesion kinase,FAK)的活化情况.进一步分析和阐明了TGF-β<,2>促进后发性白内障形成的机理.
[研究方法]：
培养的人晶状体上皮细胞株HLE B-3,用100 pg/ml的TGF-β<,2>处理后,检测细胞粘附和移行的改变.通过激光共聚焦及流式细胞仪测定细胞内整合素β<,1>亚型的蛋白表达,应用实时荧光定量RT-PCR法检测整合素β<,1>的mRNA的表达.用Westem-blot法分别测定细胞内总FAK及其磷酸化Tyr 576蛋白的表达情况.最后,使用抗整合素β<,1>的单克隆抗体阻断细胞内整合素β<,1>后,检测对细胞粘附和移行的影响.
[研究结果]：
TGF-β<,2>可以引起HLECs的凋亡,但仍有>70﹪的细胞存活下来.TGF-β<,2>的处理能够引起该部分细胞粘附和移行力随着时间的延长明显升高;同时,细胞内整合素β<,1>的表达明显升高(P<0.05);其相关的FAK的磷酸化水平明显升高(P<0.05).应用抗整合素β<,1>的单克隆抗体预处理细胞后,能够明显抑制TGF-β<,2>引起的细胞粘附和移行.
[研究结论]：
TGF-β<,2>能够明显促进HLECs的粘附和移行;整合素β<,1>及其相关的FAK的磷酸化参与了该过程并发挥重要作用.