【摘 要】
：
谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）是典型的革兰氏阳性菌,具有无内毒素,可高密度生产且易于分泌等优良特性,是目前工业生产重组蛋白的潜在宿主。本研究通过常压室温等离子体（Atmospheric and room temperature plasma,ARTP）新型技术对C.glutamicum进行诱变和高通量筛选（high-throughput screening,H
论文部分内容阅读
谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）是典型的革兰氏阳性菌,具有无内毒素,可高密度生产且易于分泌等优良特性,是目前工业生产重组蛋白的潜在宿主。本研究通过常压室温等离子体（Atmospheric and room temperature plasma,ARTP）新型技术对C.glutamicum进行诱变和高通量筛选（high-throughput screening,HTS）,获得高产重组蛋白的宿主,并通过在该宿主中表达其他重组蛋白和放大培养以验证其在工业生产中的应用性。最后采用全基因组从头测序和重测序策略,利用生物信息学分析技术,在诱变高产菌株中挖掘与提高重组蛋白表达水平相关的靶基因并对这些靶基因进行了结构和功能分析,具体有以下研究成果:（1）为了获得重组蛋白表达的高产菌株,以增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein,EGFP）作为报告蛋白,C.glutamicum CGMCC1.15647为原始菌株,探索出ARTP诱变的最佳时间为120 s;每轮ARTP诱变和HTS后获得一株高产菌株,经过三轮共获得三株重组蛋白高产菌株1-C2、2-A8和3-A6,其中3-A6的荧光值最高,比野生型菌株（wild type,WT）提高了111%;进一步通过测定其生长曲线验证了1-C2、2-A8和3-A6的生长稳定性良好,并通过传代实验验证了最优菌株3-A6的遗传稳定性良好。（2）为了探索导致重组蛋白增强的因素并验证其实用性,分别测定突变质粒MUT-EGFP以及突变菌株MA6的荧光强度,探索出是菌株的变异导致荧光值增强;在MC2,MA8和MA6菌株中表达糖蛋白D（glycoprotein D protein,g D）、I型胶原蛋白的N末端前肽（procollagen typeⅠN-terminal peptide,PINP）、内切木聚糖酶（endoxylanase,Xyn A）和抗体重链可变区（variable domain of heavy chin of heavy-chin antibody,VHH）四种重组蛋白,验证了突变株同样能够提高蛋白产量;通过5 L发酵罐在野生型菌株和最优MA6菌株中生产高价值重组蛋白VHH,验证该菌株放大生产的效果,在MA6菌株中的产量约862 mg·L-1,比WT提高了91%。结果证明通过ARTP和HTS后我们获得了一株重组蛋白高产的菌株MA6。（3）为了挖掘突变高产菌株中与重组蛋白表达产量相关的靶基因,对C.glutamicum和突变菌株MC2,MA8和MA6分别进行了全基因组从头测序以及重测序,挖掘出33个单核苷酸多态位点（single-nucleotide polymorphisms,SNP）和7个插入或缺失位点（insertion or deletion,In Del）,主要涉及五个基因,结合生物信息学分析这五个基因的结构及其功能,包括脱氢酶/还原酶,限制性核酸内切酶Mcr A,酪氨酸重组酶Xer C,Clp C蛋白酶;通过测定SNP基因过表达和敲除菌株的生长曲线和EGFP的表达情况,证明这些SNP基因表达变化对菌株生长影响不大,但对EGFP表达水平有较大影响,其中over-2370和ko-973-974菌株的EGFP表达水平最高。进一步在over-2370和ko-973-974菌株中进行重组人特立帕肽（recombinant human teriparatide,rt PTH）的表达生产,发现其产量均比WT提高了近一倍。这表明基因GL002370和GL000974与重组蛋白表达密切相关,这不仅为后续研究中优化改良底盘细胞提供潜在靶点,也为优化蛋白表达宿主提高其表达能力提供了一种技术策略。
其他文献
“生活决定意识”是对马克思哲学革命的纲领性概括。对于这场哲学革命的准确理解,要求我们在生活世界中摒弃意识的先验存在,从人们的实际生活过程中揭示出意识的源始发生。马克思的生活世界思想贯穿于其哲学思想发展的始终。从博士论文时期对自我意识立场的保留态度,到《德法年鉴》时期对自我意识的扬弃;从对现成之物的抽象直观,到对感性世界之属人本质的历史生成过程的把握;马克思在物质利益难题的启发下转向现实生活世界,在
门诊药房是药学服务的重要场所，目前门诊药房的实习生带教工作没有统一的模式，在实习生带教过程中存在各种问题。文章探索了基于药学服务为导向的门诊药房实习生教学改革方案。以某院门诊药房实习生教学改革实践为例，从实习生岗前培训、质量安全管理、处方调配、处方审核、用药指导、药物咨询以及医患沟通等培训，分析如何构建以药学服务为导向的实习生教学模式。通过对门诊药房实习生的教学改革，有助于提高药学实习生的药学服务
体育赛事助力农村体育，既是乡村振兴的应有之义，也是推动乡村发展的有力抓手。本文基于产业经济学相关理论，采用文献资料、专家访谈等方法，以“村BA”篮球赛为视角，通过审视体育赛事助推乡村振兴的价值，探究体育赛事助推乡村振兴存在的困境，提出有效发展路径。最后建议：因地制宜，激发乡村振兴内生动力；以旧改新，加快基层文化体育设施建设；独树一帜，营造乡村体育品牌效应；独树一帜，营造乡村体育品牌效应。
目的:癌因性疲乏（Cancer-related fatigue,CRF）是临床癌症患者中较为高发的严重并发症,在众多癌症类型中,肺癌CRF的发生率较高。CRF对患者的生活质量和预后产生着十分不良的影响。虽然CRF的干预方法被许多研究所探讨,但目前美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network,NCCN）指南中只有有氧运动在CRF的干预方法中具有Ⅰ类
随着人民生活水平的提高,对于优质白酒的需求持续增加,推动白酒质量全面提升迫在眉睫。白酒中的微量组分是决定白酒风味品质的重要因素,科学评价白酒质量,明晰不同品质白酒差异是提高白酒品质的前提和关键。本研究利用风味化学首次全面解析了小曲清香型白酒的化学本质;利用化学计量学对微量香气组分量比关系对于小曲清香型白酒风格及品质的影响进行探究。主要研究内容如下:（1）通过顶空固相微萃取和液液微萃取两种前处理技术
人口老龄化是发达国家的重要特征，但却成为当前制约我国经济发展的重要经济特征，尤其会弱化货币政策有效性。基于宏观层面和省级层面，本文运用交互向量自回归（I-VAR）模型和面板同质向量自回归（PCH-VAR）模型研究人口老龄化对货币政策有效性的时变影响特征及其内在传导机制，主要得到如下三点发现：第一，从宏观层面看，随着人口老龄化的不断加剧，我国数量型货币政策对产出、通货膨胀和信贷的边际调控效率趋于下降
制度建设贯穿于党的各项建设之中,为推进党的自我革命提供坚强保障。党的十九届四中全会将不忘初心牢记使命主题教育上升为党内制度规范,提出建立不忘初心牢记使命制度。这既是对不忘初心牢记使命政治命题的制度性延续,也是对党内主题教育成果的创造性转化,有效增强党的执政能力和领导水平。不忘初心牢记使命制度是在中国特色社会主义进入新时代背景下,中国共产党基于现实需要,以党的创新理论为指导,以党内主题教育的成功开展
随着工坊啤酒（craft beer）的迅猛发展,大量的研究工作聚焦于啤酒新产品的开发,而功能性啤酒将引领着工坊啤酒的发展。其中,抗氧化活性一直是国内外相关领域学者的研究热点。现代医学研究表明自由基具有强氧化性,会损害机体的细胞和组织,导致癌症、心血管疾病等的发生。因此,人体必须从饮食中摄入天然抗氧化剂,以防止自由基引起的损伤。生产富含抗氧化物质的啤酒可以有效增加天然抗氧化剂的摄入。而筛选具有高抗氧
枯草芽孢杆菌是一种常见的革兰氏阳性菌模式生物,被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration,FDA）确认为安全的菌（Generally recognized as safe,GRAS）。枯草芽孢杆菌因其生长速度快、蛋白分泌能力强等特点,被广泛应用于工业酶制剂的制造、代谢产品的合成和基础研究中。但是目前枯草芽孢杆菌转录后调控工具缺乏,而且目的基因的表达大多依赖基