论文部分内容阅读
柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)属于顶复器门原虫,严重危害养鸡业。顶膜抗原1(Apical membrane antigen-1,AMA1)是顶复器门原虫入侵宿主细胞前形成运动连接环的重要组成部分。本实验室在前期,对柔嫩艾美耳球虫AMA1(EtAMA1)的特性进行了初步研究,发现EtAMA1在子孢子中的mRNA转录水平和蛋白翻译水平均高于第二代裂殖子,在子孢子的胞膜蛋白和胞质蛋白均有表达,而在第二代裂殖子主要在胞膜蛋白中表达,其抗体可明显抑制子孢子入侵宿主细胞。为探索EtAMA1不同结构域对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵宿主细胞过程中的影响,进行了本项研究。1.柔嫩艾美耳球虫在鸡胚成纤维原代细胞体外培养模型的建立取9日龄SPF级鸡胚,无菌环境中去除胚胎的头、翅和肢体,清除内脏,用无菌PBS冲洗鸡胚组织块,制成糜状组织,经消化、离心、过滤等获得原代细胞,经培养、检验、传代建立鸡胚成纤维细胞培养体系。将柔嫩艾美耳球虫子孢子接种鸡胚成纤维原代细胞,观察虫体在细胞中培养至76 h的生长发育情况。子孢子在接种5 h开始侵入细胞,至24 h时多数虫体已在细胞内发育,72 h出现团状的裂殖体,76 h裂殖子开始从细胞溢出。根据柔嫩艾美耳球虫生活史判断,实验结果与在鸡盲肠发育结果相似,表明球虫在鸡胚成纤维原代细胞体外培养模型构建成功,为研究EtAMA1在虫体入侵过程中的作用奠定了基础。2.EtAMA1不同结构域对球虫子孢子入侵的影响根据EtAMA1结构域Ⅰ(DⅠ)设计引物,克隆获得EtAMA1-DⅠ基因,构建原核重组表达质粒pGEX-4T-2-EtAMA1-DⅠ,并转入大肠杆菌BL21感受态细胞中诱导表达蛋白,使用Ni柱亲和层析纯化重组蛋白后,免疫新西兰大白兔制备多克隆血清抗体。用合成的Et AMA1-DⅢ多肽和信号肽及制备的rEtAMA1-DⅠ抗体孵育子孢子均对虫体入侵产生一定的抑制作用,滑行运动和粘附实验显示EtAMA1-DⅢ对虫体入侵前期的运动有部分影响。结果表明,EtAMA1中的DⅠ、DⅢ、信号肽在虫体入侵过程中均发挥了一定作用。3.EtAMA1-DⅠ与棒状体颈部蛋白2互作关系的研究以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板,PCR扩增柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2(Et RON2)和Et AMA1-DⅠ基因,构建重组真核表达质粒pBiFC-VN155-EtAMA1-DⅠ、pBiFC-VC155-EtRON2,转染BHK细胞进行表达,利用间接免疫荧光(IFA)对其表达情况进行鉴定。结果检测到特异性的绿色荧光,表明构建的重组质粒pBiFC-VN155-EtAMA1-DⅠ、pBiFC-VC155-EtRON2在真核细胞BHK中表达。通过BiFC技术对EtRON2与EtAMA1-DⅠ相互作用关系进行验证,结果显示共转染的p BiFC-VN155-EtAMA1-DⅠ和pBiFC-VC155-EtRON2组、pBiFC-bJunVN173和pBiFC-bFosVC155阳性对照组均出现特异性绿色荧光,而阴性对照组未激发出绿色荧光,说明EtAMA1-DⅠ和Et RON2之间存在互作关系。因此,推测EtAMA1-DⅠ与Et RON2发生互作形成复合体,在球虫入侵宿主细胞中发挥重要功能。4.EtAMA1与宿主细胞互作蛋白的筛选已有研究表明,AMA1能与多个虫体蛋白形成复合物,是虫体成功入侵细胞的关键。但至今尚无AMA1与宿主蛋白互作的报道。本实验从宿主细胞出发,拟筛选与EtAMA1胞外域存在互作的宿主细胞(DF-1细胞)蛋白。对已构建的原核表达质粒GST-EtAMA1进行重组蛋白的表达与纯化,纯化的GST-rEtAMA1经Western blot验证,在约72 kDa处有单一的目的条带,证实所获得的蛋白为GST-EtAMA1融合蛋白。将GST-EtAMA1蛋白、GST蛋白和PBS分别与谷胱甘肽琼脂糖共孵育后,分别与DF-1细胞蛋白共孵育,洗脱液经SDS-PAGE,结果显示三者之间的条带明显不同,将差异条带切下进行质谱分析,获得的蛋白质肽段与Uniprot中鸡蛋白质数据库进行blast比对,初步获得14个Et AMA1胞外域与DF-1细胞之间存在相互作用的潜在蛋白,包括肌动蛋白、微管蛋白、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白、核糖体蛋白以及一些保守蛋白等。研究结果为进一步阐明EtAMA1胞外域在球虫入侵宿主细胞中发挥重要作用的分子机制奠定基础。