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蛋白质是构成生命的重要物质基础，其在动物体内的代谢周转能直接影响动物的生长发育和骨骼肌的蛋白质沉积。蛋白质在骨骼肌的沉积量主要取决于肌肉蛋白质合成和蛋白质降解两方面的综合效应。α-酮戊二酸（α-ketoglutarate acid，AKG）是三羧酸循环（TCA循环）的关键中间产物，同时也是谷氨酸的代谢产物，具有抗氧化、抗应激及改善动物机体能量代谢等生物学功能。有研究表明，AKG可激活Hela细胞的通路mTOR通路，但AKG对骨骼肌蛋白质合成和降解有无影响尚无报道，其作用机制也有待揭示。本研究包括以下5个部分。
第一部分：AKG对小鼠生长发育及骨骼肌蛋白质代谢的影响
为研究 AKG在骨骼肌蛋白质代谢中的作用，本试验以小鼠为对象，首先通过小鼠跑步机给予其正常运动、低速运动和高速运动的刺激，观察小鼠血清和肌肉中AKG浓度的变化。结果表明，随运动强度增加，小鼠血清、比目鱼肌和腓肠肌中 AKG浓度均显著增加。进一步通过腹腔急性注射0.6 g/kg AKG3 h及长期饮水添加2%AKG8周，研究AKG对小鼠生长发育及骨骼肌蛋白质合成的影响。结果表明，腹腔注射 AKG显著增加了小鼠腓肠肌嘌呤霉素（蛋白质合成的标记物）掺入量，以及mTOR下游S6和4E-BP1的磷酸化，显著抑制了蛋白质降解相关基因MuRF1和MAFbx的表达。饮水添加2%AKG显著促进了小鼠平均体增重和累积采食量，增加了小鼠腓肠肌重及肌纤维面积，增强了小鼠的抓握力，并延长了快速和慢速运动的时间。AKG显著增加小鼠血清中总蛋白、白蛋白和胰岛素样生长因子（IGF-1）的水平，并显著降低血清尿素氮（BUN）的含量。AKG还显著促进了小鼠腓肠肌Akt、mTOR、S6、4E-BP1和FoxO1的磷酸化，抑制了MuRF1和MAFbx的表达。以上结果表明：AKG可显著促进小鼠腓肠肌蛋白质合成，抑制蛋白质降解。
第二部分：AKG促进骨骼肌细胞蛋白质合成的机制
前文研究表明，饮水添加AKG和腹腔注射AKG均能显著促进小鼠骨骼肌蛋白质沉积。但饮水或腹腔注射的AKG有可能在体内被转化为其代谢产物而发挥作用。为研究AKG促进骨骼肌蛋白质合成是否是其直接的作用，本试验以C2C12细胞为模型，通过在培养液分别添加2 mM AKG和Glu处理48 h，研究其对骨骼肌细胞蛋白质合成的影响。结果表明，AKG显著促进了C2C12细胞总蛋白浓度和嘌呤霉素的掺入量，促进了mTOR及下游S6和4E-BP1的磷酸化及MHCII的表达。但Glu对细胞总蛋白浓度及mTOR下游信号分子均无显著影响。上述结果表明：AKG能直接促进骨骼肌细胞蛋白质合成，而不通过代谢成其中间产物发挥作用。
第三部分：AKG调控其受体及蛋白质合成的信号通路
前文研究已发现，离体和在体条件下，AKG均能显著促进骨骼肌蛋白质合成。为进一步揭示其作用机理，本试验以C2C12细胞为模型，并使用2 mM AKG处理C2C12细胞1、2和4 h研究其对Akt/mTOR和Akt/FoxO1通路的调控作用。结果表明，AKG处理不同时间可分别能够激活Akt/mTOR和Akt/FoxO1通路。同时，Akt和mTOR通路的阻断剂研究结果也发现，阻断Akt和mTOR可分别显著阻断AKG对Akt/mTOR及Akt/FoxO1通路的激活。
已有研究报道，GPR99和GPR91是AKG的受体，但本文研究发现，骨骼肌细胞上不表达GPR99，仅有GPR91的表达，且其可响应AKG的作用。通过RNA干扰手段降低骨骼肌细胞膜GPR91的表达，结果表明，干扰GPR91并不能阻断AKG对MuRF1和MAFbx的抑制作用，但可阻断AKG促进S6和4E-BP1的磷酸化作用，未能阻断AKG促进mTOR的磷酸化的激活作用，以上结果说明，GPR91部分介导了AKG促进骨骼肌蛋白质合成的作用。
本研究还发现，骨骼肌能表达一类依赖 AKG的氧感应器，脯氨羟化酶（PHD）。其中，脯氨羟化酶（PHD3）在的表达量最高，其次分别是PHD1和PHD2，且AKG可显著抑制骨骼肌细胞PHD3的表达。进一步通过在C2C12细胞中过表达PHD3的研究发现，过表达PHD3可显著阻断 AKG促进 C2C12细胞嘌呤霉素掺入量及肌管直径的作用，且显著阻断了 AKG对mTOR信号通路的激活作用，以及AKG对FoxO1/MuRF1/MAFbx的抑制作用。上述结果表明，PHD3在介导AKG促进骨骼肌蛋白质合成中发挥了重要作用。
第四部分：β2-肾上腺素能受体（ADRB2）介导AKG促进骨骼肌蛋白质合成
大量研究表明，ADRB2在骨骼肌肥大及蛋白质合成中发挥重要的作用，且PHD3可通过羟基化ADRB2，进一步泛素化降解ADRB2。为研究PHD3/ADRB2在AKG调控骨骼肌蛋白质合成与降解中的作用，本文发现，PHD3和ADRB2存在显著的互作效应，而AKG可降低这种互作效应，从而降低PHD3对ADRB2的羟化作用，且可显著降低ADRB2的泛素化。进一步采用 ADRB2阻断剂与 AKG共处理 C2C12细胞和小鼠活体，结果表明，阻断 ADRB2可显著阻断AKG对mTOR信号通路的激活，并阻断AKG对FoxO1/MuRF1抑制的效应。此外，通过腓肠肌注射ADRB2的慢病毒干扰载体降低肌肉中ADRB2的表达，并饮水添加2%AKG饲喂小鼠8周，结果表明，干扰ADRB2可显著降低小鼠肌肉抓握力及快速和慢速运动时间，显著阻断了AKG增加小鼠腓肠肌重和纤维面积。干扰ADRB2显著阻断AKG对mTOR信号通路的激活，以及AKG对MuRF1和MAFbx的抑制作用。以上结果表明：PHD3/ADRB2可介导AKG调控骨骼肌蛋白质合成与降解的作用。
第五部分：AKG在缓解肌肉萎缩及蛋白质降解中的作用
蛋白质周转包括蛋白质合成与降解。前文研究发现，AKG可显著促进骨骼肌蛋白质合成。为探讨AKG在蛋白质降解中是否也具有调节作用，本试验以肌肉萎缩小鼠（DMD）为模型，通过饮水添加2%AKG8周，观察其对小鼠蛋白质代谢的影响。结果表明，DMD小鼠虽能维持比较正常的生长及代谢，但腓肠肌出现较严重的损伤。饮水添加 AKG可显著缓解腓肠肌损伤，增加腓肠肌重及肌纤维面积，并显著促进其体增重。AKG还可显著提高DMD小鼠的肌肉抓握力和运动耐力，显著下调DMD小鼠MuRF1和MAFbx的表达。本试验还通过腹腔注射皮质酮，诱导小鼠肌肉蛋白质降解；同时注射AKG，研究其对骨骼肌蛋白质降解的缓解的作用。结果表明，AKG显著缓解了皮质酮导致的骨骼肌FoxO1及其下游MuRF1和MAFbx的增加作用。以上结果表明，AKG可显著缓解DMD小鼠的肌肉萎缩及皮质酮诱导的肌肉蛋白质降解。
综上，本论文的研究结果表明：AKG可显著促进骨骼肌蛋白质合成，抑制蛋白质降解，促进骨骼肌纤维直径增加。其作用机理是通过抑制骨骼肌PHD3的表达，抑制ADRB2的羟基化，激活骨骼肌ADRB2及其下游Akt/mTOR和抑制FoxO1信号通路，一方面促进蛋白质合成，另一方面抑制蛋白质降解，从而实现骨骼肌纤维直径增加和肌肉肥大。AKG还可通过抑制MuRF1和MAFbx的表达，显著缓解DMD小鼠的肌肉萎缩及皮质酮诱导的肌肉蛋白质降解。上述研究结果比较深入地揭示了营养代谢中间产物 AKG具有调控骨骼肌蛋白质代谢的作用，丰富了对中间代谢产物生理功能的新认识，而且对进一步通过调控肌肉萎缩、缓解肌肉疲劳和肌无力等促进人类健康的研究具有借鉴意义，对养猪生产中有效调控猪胴体性状和产肉率也具有较重要的参考价值。
第一部分：AKG对小鼠生长发育及骨骼肌蛋白质代谢的影响
为研究 AKG在骨骼肌蛋白质代谢中的作用，本试验以小鼠为对象，首先通过小鼠跑步机给予其正常运动、低速运动和高速运动的刺激，观察小鼠血清和肌肉中AKG浓度的变化。结果表明，随运动强度增加，小鼠血清、比目鱼肌和腓肠肌中 AKG浓度均显著增加。进一步通过腹腔急性注射0.6 g/kg AKG3 h及长期饮水添加2%AKG8周，研究AKG对小鼠生长发育及骨骼肌蛋白质合成的影响。结果表明，腹腔注射 AKG显著增加了小鼠腓肠肌嘌呤霉素（蛋白质合成的标记物）掺入量，以及mTOR下游S6和4E-BP1的磷酸化，显著抑制了蛋白质降解相关基因MuRF1和MAFbx的表达。饮水添加2%AKG显著促进了小鼠平均体增重和累积采食量，增加了小鼠腓肠肌重及肌纤维面积，增强了小鼠的抓握力，并延长了快速和慢速运动的时间。AKG显著增加小鼠血清中总蛋白、白蛋白和胰岛素样生长因子（IGF-1）的水平，并显著降低血清尿素氮（BUN）的含量。AKG还显著促进了小鼠腓肠肌Akt、mTOR、S6、4E-BP1和FoxO1的磷酸化，抑制了MuRF1和MAFbx的表达。以上结果表明：AKG可显著促进小鼠腓肠肌蛋白质合成，抑制蛋白质降解。
第二部分：AKG促进骨骼肌细胞蛋白质合成的机制
前文研究表明，饮水添加AKG和腹腔注射AKG均能显著促进小鼠骨骼肌蛋白质沉积。但饮水或腹腔注射的AKG有可能在体内被转化为其代谢产物而发挥作用。为研究AKG促进骨骼肌蛋白质合成是否是其直接的作用，本试验以C2C12细胞为模型，通过在培养液分别添加2 mM AKG和Glu处理48 h，研究其对骨骼肌细胞蛋白质合成的影响。结果表明，AKG显著促进了C2C12细胞总蛋白浓度和嘌呤霉素的掺入量，促进了mTOR及下游S6和4E-BP1的磷酸化及MHCII的表达。但Glu对细胞总蛋白浓度及mTOR下游信号分子均无显著影响。上述结果表明：AKG能直接促进骨骼肌细胞蛋白质合成，而不通过代谢成其中间产物发挥作用。
第三部分：AKG调控其受体及蛋白质合成的信号通路
前文研究已发现，离体和在体条件下，AKG均能显著促进骨骼肌蛋白质合成。为进一步揭示其作用机理，本试验以C2C12细胞为模型，并使用2 mM AKG处理C2C12细胞1、2和4 h研究其对Akt/mTOR和Akt/FoxO1通路的调控作用。结果表明，AKG处理不同时间可分别能够激活Akt/mTOR和Akt/FoxO1通路。同时，Akt和mTOR通路的阻断剂研究结果也发现，阻断Akt和mTOR可分别显著阻断AKG对Akt/mTOR及Akt/FoxO1通路的激活。
已有研究报道，GPR99和GPR91是AKG的受体，但本文研究发现，骨骼肌细胞上不表达GPR99，仅有GPR91的表达，且其可响应AKG的作用。通过RNA干扰手段降低骨骼肌细胞膜GPR91的表达，结果表明，干扰GPR91并不能阻断AKG对MuRF1和MAFbx的抑制作用，但可阻断AKG促进S6和4E-BP1的磷酸化作用，未能阻断AKG促进mTOR的磷酸化的激活作用，以上结果说明，GPR91部分介导了AKG促进骨骼肌蛋白质合成的作用。
本研究还发现，骨骼肌能表达一类依赖 AKG的氧感应器，脯氨羟化酶（PHD）。其中，脯氨羟化酶（PHD3）在的表达量最高，其次分别是PHD1和PHD2，且AKG可显著抑制骨骼肌细胞PHD3的表达。进一步通过在C2C12细胞中过表达PHD3的研究发现，过表达PHD3可显著阻断 AKG促进 C2C12细胞嘌呤霉素掺入量及肌管直径的作用，且显著阻断了 AKG对mTOR信号通路的激活作用，以及AKG对FoxO1/MuRF1/MAFbx的抑制作用。上述结果表明，PHD3在介导AKG促进骨骼肌蛋白质合成中发挥了重要作用。
第四部分：β2-肾上腺素能受体（ADRB2）介导AKG促进骨骼肌蛋白质合成
大量研究表明，ADRB2在骨骼肌肥大及蛋白质合成中发挥重要的作用，且PHD3可通过羟基化ADRB2，进一步泛素化降解ADRB2。为研究PHD3/ADRB2在AKG调控骨骼肌蛋白质合成与降解中的作用，本文发现，PHD3和ADRB2存在显著的互作效应，而AKG可降低这种互作效应，从而降低PHD3对ADRB2的羟化作用，且可显著降低ADRB2的泛素化。进一步采用 ADRB2阻断剂与 AKG共处理 C2C12细胞和小鼠活体，结果表明，阻断 ADRB2可显著阻断AKG对mTOR信号通路的激活，并阻断AKG对FoxO1/MuRF1抑制的效应。此外，通过腓肠肌注射ADRB2的慢病毒干扰载体降低肌肉中ADRB2的表达，并饮水添加2%AKG饲喂小鼠8周，结果表明，干扰ADRB2可显著降低小鼠肌肉抓握力及快速和慢速运动时间，显著阻断了AKG增加小鼠腓肠肌重和纤维面积。干扰ADRB2显著阻断AKG对mTOR信号通路的激活，以及AKG对MuRF1和MAFbx的抑制作用。以上结果表明：PHD3/ADRB2可介导AKG调控骨骼肌蛋白质合成与降解的作用。
第五部分：AKG在缓解肌肉萎缩及蛋白质降解中的作用
蛋白质周转包括蛋白质合成与降解。前文研究发现，AKG可显著促进骨骼肌蛋白质合成。为探讨AKG在蛋白质降解中是否也具有调节作用，本试验以肌肉萎缩小鼠（DMD）为模型，通过饮水添加2%AKG8周，观察其对小鼠蛋白质代谢的影响。结果表明，DMD小鼠虽能维持比较正常的生长及代谢，但腓肠肌出现较严重的损伤。饮水添加 AKG可显著缓解腓肠肌损伤，增加腓肠肌重及肌纤维面积，并显著促进其体增重。AKG还可显著提高DMD小鼠的肌肉抓握力和运动耐力，显著下调DMD小鼠MuRF1和MAFbx的表达。本试验还通过腹腔注射皮质酮，诱导小鼠肌肉蛋白质降解；同时注射AKG，研究其对骨骼肌蛋白质降解的缓解的作用。结果表明，AKG显著缓解了皮质酮导致的骨骼肌FoxO1及其下游MuRF1和MAFbx的增加作用。以上结果表明，AKG可显著缓解DMD小鼠的肌肉萎缩及皮质酮诱导的肌肉蛋白质降解。
综上，本论文的研究结果表明：AKG可显著促进骨骼肌蛋白质合成，抑制蛋白质降解，促进骨骼肌纤维直径增加。其作用机理是通过抑制骨骼肌PHD3的表达，抑制ADRB2的羟基化，激活骨骼肌ADRB2及其下游Akt/mTOR和抑制FoxO1信号通路，一方面促进蛋白质合成，另一方面抑制蛋白质降解，从而实现骨骼肌纤维直径增加和肌肉肥大。AKG还可通过抑制MuRF1和MAFbx的表达，显著缓解DMD小鼠的肌肉萎缩及皮质酮诱导的肌肉蛋白质降解。上述研究结果比较深入地揭示了营养代谢中间产物 AKG具有调控骨骼肌蛋白质代谢的作用，丰富了对中间代谢产物生理功能的新认识，而且对进一步通过调控肌肉萎缩、缓解肌肉疲劳和肌无力等促进人类健康的研究具有借鉴意义，对养猪生产中有效调控猪胴体性状和产肉率也具有较重要的参考价值。