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水貂出血性肺炎是危害水貂的重要疫病,给水貂养殖业造成了重大的经济损失。早期研究认为水貂出血性肺炎是由铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa）感染引起。但近十年研究表明,P.aeruginosa单一感染水貂时,致病性并不强,很难诱发水貂出血性肺炎。H9N2甲型流感病毒（Influence A virus,IAV）作为一种常见的呼吸道病毒,在水貂群中广泛存在,但单一感染仅引起水貂轻症呼吸道疾病。P.aeruginosa是常见的条件致病菌,当动物受到其他病原体感染时,很容易引发P.aeruginosa感染。本实验室前期研究结果表明,H9N2 IAV与P.aeruginosa共感染易导致水貂出血性肺炎,死亡率显著增加。但H9N2 IAV与P.aeruginosa共感染的分子机制尚不明确。脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）是P.aeruginosa等革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分,同时也是P.aeruginosa重要的毒力因子,具有多种生物活性,能激活固有免疫应答。为了进一步探究H9N2 IAV和P.aeruginosa共感染导致水貂出血性肺炎的分子机制,本研究建立了Mk/SD/F10/13（H9N2）与P.aeruginosa LPS体外共感染/刺激巨噬细胞研究模型。本研究采取热酚水法提取LPS。对提取的LPS进行产量、核酸含量、蛋白含量、多糖含量的检测,并采用银染试验对提取物进行鉴定。结果显示,提取的LPS平均产率为2.24%,核酸含量为0.083%,多糖含量为15.6%,蛋白含量为0.37%。银染试验结果,提取的LPS与标准品大肠杆菌LPS均呈现典型的多糖样条带。这表明提取的P.aeruginosa LPS产率高、纯度高,具有较高生物活性。为探究H9N2 IAV与P.aeruginosa LPS共感染/刺激对小鼠巨噬细胞（MH-S）的免疫应答调控,设立H9N2IAV单一感染MH-S细胞（H9N2/MH-S）、P.aeruginosa LPS单一刺激MH-S细胞（LPS/MH-S）、H9N2 IAV与P.aeruginosa LPS共感染/刺激MH-S细胞（H9N2+LPS/MH-S）,H9N2 IAV接种剂量均为MOI=1,LPS接种剂量均为10μg/ml,另外设空白对照（Control）,对照细胞接种同体积的无菌2%FBS的RPMI1640营养液。分别在用H9N2 IAV与LPS接种/或刺激细胞后1、3、6、9、12 h时,使用qRTPCR方法检测MH-S细胞中H9N2 IAV的病毒核酸水平。结果显示,1 h时,H9N2/MH-S细胞和H9N2+LPS/MH-S细胞H9N2 IAV核酸水平没有明显差异,但在3、6、9、12 h,H9N2/MH-S细胞的H9N2 IAV核酸水平明显高于H9N2+LPS/MH-S细胞,差异显著,这表明LPS干扰了H9N2 IAV的增殖。采用流式细胞术检测细胞的凋亡水平。结果,1 h时,H9N2/MH-S细胞、LPS/MH-S细胞、H9N2+LPS/MH-S细胞均比对照细胞凋亡率高,差异显著。H9N2/MH-S细胞与H9N2+LPS/MH-S细胞凋亡率无明显差异,但两组的凋亡率均高于LPS/MH-S细胞,差异显著。在12 h时,H9N2/MH-S细胞、LPS/MH-S细胞、H9N2+LPS/MH-S细胞均比对照细胞凋亡率高,差异显著。H9N2+LPS/MH-S细胞凋亡率明显高于H9N2/MH-S细胞和LPS/MH-S细胞。由此可见,较于单一感染细胞,共感染/刺激对细胞的破坏作用更强,LPS对细胞具有较强的毒性作用,细胞功能受损是导致H9N2 IAV复制减缓的一个原因。使用qRT-PCR检测细胞因子mRNA表达水平。结果表明,随着感染/刺激时间的延长,总体上细胞因子mRNA表达水平先升高后下降。在3、6、9、12 h时,H9N2+LPS/MH-S细胞趋化因子CCL5、CXCL10和细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10的mRNA表达水平均高于H9N2/MH-S细胞和LPS/MH-S细胞,差异显著。6 h时,H9N2+LPS/MH-S细胞TLR4 mRNA表达水平达到最高,9、12 h时表达量低于H9N2/MH-S细胞,H9N2/MH-S细胞TLR4 mRNA表达量水平呈现递增的趋势。H9N2+LPS/MH-S细胞和H9N2/MH-S细胞TLR4 mRNA表达水平均高于LPS/MH-S细胞,TLR4过度激活导致大量炎性因子分泌,导致细胞因子风暴,对组织细胞产生病理损伤。分别在1、6、12 h时,使用ELISA检测细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10、IFN-α蛋白水平。结果表明,随着感染/刺激时间的增加,IFN-α、TNF-α、IL-1β、IL-10蛋白表达水平不断升高。H9N2+LPS/MH-S细胞IFN-α、TNF-α、IL-1β、IL-10蛋白水平高于H9N2/MH-S细胞和LPS/MH-S细胞,差异显著。由此可见,较与单一感染细胞,共感染/刺激细胞的细胞因子分泌更高、免疫反应更剧烈,这会对细胞造成更严重的损伤。综上所述,H9N2 IAV与LPS均能引起巨噬细胞产生免疫应答,但H9N2 IAV与LPS共感染/刺激具有协同作用,诱导更强烈的细胞免疫应答,促炎因子表达水平高,细胞损伤更为严重。本研究丰富了H9N2 IAV与P.aeruginosa共感染致病机制的研究数据,为水貂出血性肺炎和人类重症肺炎的防控提供了理论依据。