论文部分内容阅读
本实验室已研制出的流感病毒、肝炎病毒中和抗体具有临床应用潜力,需要大量的抗体用临床前研究。此外,诊断试剂盒与疫苗相关研究也需要大量具有天然构象与活性的病毒结构蛋白,需要一个高效、经济的哺乳动物表达平台。课题组前期已建立基于CHO-S与HEK293等细胞的瞬时基因表达平台,表达量分别为15mg/L与80mg/L,课题组还引进了CHO系列中的FIp-In及DHFR-缺陷系统等稳定基因表达系统,为外源蛋白高表达提供了条件。 但在表达过程中,培养基几乎占据了表达成本的一半,大量表达时培养基耗费极大,此外商业培养基配方保密,如果存在干扰转染或后续纯化的物质,无法排除,会使工艺变得极为复杂。为解决培养基的问题,本研究首先通过选择合适的评价体系,确立了各类营养混合液的配制方法与添加阈值,结合文献、专利报道的添加范围与其它无血清培养添加因子,通过相互组合形成基础培养基库,筛选获得L1,M1两种最有潜力的基础培养基。通过配方分析,设计了L1与M1的混合测试,培养效果得到极大提高,最高活细胞密度提高3倍,培养周期延长到6天以上。 本研究还发现,PVA可以减少细胞因为剪切力伤害造成的细胞破碎,还具有促进细胞增殖的效果,结合硫酸葡聚糖以及微量元素混合液的使用,细胞在含PVA的培养基中不会相互聚集成团或贴附在瓶壁上,生长状态得到极大改善。本研究还对培养基的配制顺序进行分析与测试,确定最佳配制顺序后通过调节NaCl的含量最终获得了最优培养基L1/M1,在后期培养、表达验证中,该培养基适用于细胞传代培养、冻存以及复苏。通过去除TFR以及在L1基础上添加BSA与Yeast extract还获得了能够较好支持细胞培养的L1/M1-TFR与L1YB培养基,以上三种培养基的成本相较于商业培养基降低三分之二以上,为动物细胞大规模培养提供便利。 本研究通过配方分组测试,迅速排除了干扰转染的物质,使用L1/M1表达多种抗体和蛋白,表达量优于商业培养基,产物活性一致。其中10F7cAb的表达量达到119.8mg/L,比商业培养基提高87.2%,通过添加丙戊酸,结合低温胁迫,表达量可提高到220.2mg/L,能够满足临床前研究的产能需求。 本研究还尝试将L1/M1的脱盐浓缩液作为补料培养基进行CHO-S细胞的流加培养,相较于未补料的组合,最大活细胞密度提高30.8%,达到9.4×106cells/ml,维持时间增加3天,为稳定细胞株的补料工艺开发奠定了基础。