肾上腺皮质癌(adrenocortical carcinoma, ACC)的年发病率为0.5-2/100万人,占所有恶性肿瘤的0.02%。该肿瘤的恶性程度高,侵袭力强,且早期确诊率较低。目前ACC的治疗仍以根治手术为主,缺乏有效的药物治疗,术后复发及发生远处转移的几率较高,预后较差。近年来有关肾上腺皮质癌的研究报道越来越多,但其发生、发展的分子机制仍不清楚,所以寻找稳定、有效的基因诊断及治疗靶点,对阐明ACC发病的分子机制及提高ACC的早期诊断和治疗能力显得十分重要。PCAF(P300/CBP Associated Factor)是转录因子家族组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferases, HATs)的家族成员之一,通常存在于具有乙酰转移酶活性的复合物中,这些复合物在转录调节上的功能主要有两种：一是辅激活因子,另一种是通过使组蛋白和非组蛋白特定位点的赖氨酸残基(Lys)发生乙酰化来激活转录。大量研究结果表明,PCAF参与细胞的分化、凋亡及肿瘤形成过程,PCAF变异与癌发病有关,然而不同肿瘤中PCAF的表达却不一致：前列腺癌、肾母细胞癌及小儿中枢神经系统恶性肿瘤中PCAF呈高表达；肝细胞癌、鳞癌、胃肠恶性肿瘤中PCAF呈低表达或无表达。PCAF在肿瘤发生、发展中扮演的角色是促癌基因还是抑癌基因,尚未形成统一的观点。目前国内外关于肾上腺皮质癌发病机制的研究比较少见,而研究PCAF与肾上腺皮质癌关系的领域更是空白,本课题通过收集肾上腺皮质癌及癌旁组织,采用免疫组化法及RT-PCR法检测组织中PCAF的表达水平；根据上述实验检测结果,利用细胞分子生物学技术沉默PCAF的表达,构建稳定下调表达的肾上腺皮质癌细胞株；通过建立裸鼠肾上腺皮质癌模型,在体内验证下调PCAF对肾上腺皮质癌细胞的生物学行为的影响；最后通过免疫组化法检测裸鼠瘤体组织中相关蛋白的表达情况,进一步探讨PCAF在ACC发生、发展机制中的作用。研究内容包括以下四个部分：第一部分PCAF在肾上腺皮质癌中的表达目的：检测肾上腺皮质癌组织和癌旁正常组织中PCAF的表达水平。方法：1.收集肾上腺皮质癌患者手术标本15例及相应的癌旁正常组织6例,通过免疫组织化学法检测肾上腺皮质癌组织及癌旁正常组织中PCAF的表达水平。2.选取上述肾上腺皮质癌及癌旁正常组织,通过RT-PCR法检测肾上腺皮质癌组织及癌旁正常组织中PCAF mRNA的表达水平。结果：1.免疫组化检测结果显示,肾上腺皮质癌组织：弱阳性(+)2例、阳性(++)3例、强阳性(+++)10例,阳性率100%；癌旁正常组织：阴性(-)4例、弱阳性(+)2例,阳性率33.33%。肾上腺皮质癌组织中PCAF蛋白的阳性率明显高于癌旁正常组织,差异有统计学意义(P=0.03)。2. RT-PCR检测结果显示,肾上腺皮质癌组织中PCAF mRNA的表达水平明显高于癌旁正常组织,差异有统计学意义(t=-17.29,P=0.000)。小结：PCAF基因在肾上腺皮质癌中呈过表达。第二部分沉默PCAF的肾上腺皮质癌SW-13细胞的构建目的：获取PCAF稳定沉默表达的肾上腺皮质癌SW-13细胞株。方法：1.使用Gateway重组技术将筛选出干扰质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP构建慢病毒表达载体pLenti6.3-MiRNA-PC AF/NC,并进行质粒测序鉴定。2.通过慢病毒包装、病毒滴度检测后感染并筛选肾上腺皮质癌SW-13细胞,建立PCAF稳定沉默表达细胞株和阴性载体对照细胞株。3. RT-PCR和Western blot验证目的基因下调效果。结果：1.质粒测序结果证明pcDNATM6.2-GW/EmGFP构建成功。2. RT-PCR结果显示：实验组PCAF mRNA表达下调成功,阴性对照组(pLenti6.3-MiRNA-NC)的PCAF mRNA相对表达量为实验组(pLenti6.3-MiRNA-PCAF)的1.84倍,差异具有统计学意义(t=6.64,P=0.003); Western blot结果显示：实验组(pLenti6.3-MiRNA-PCAF)的PCAF蛋白表达较正常组(SW-13)和阴性对照组(pLenti6.3-MiRNA-NC)显著降低,差异具有统计学意义(F=20.845,P=0.002)。小结：成功构建并筛选PCAF稳定下调表达的实验组(pLenti6.3-MiRNA-PCAF)和阴性对照组(pLenti6.3-MiRNA-NC)两株人肾上腺皮质癌SW-13细胞株。第三部分沉默PCAF基因对裸鼠人肾上腺皮质癌种植瘤的影响目的：构建三组裸鼠人肾上腺皮质癌种植瘤模型,观察沉默PCAF基因对裸鼠人肾上腺皮质癌种植瘤的影响。方法：1.通过裸鼠皮下注射三种肾上腺皮质癌SW-13细胞(正常组SW-13细胞、阴性对照组SW-13细胞及PCAF下调组SW-13细胞),建立三组裸鼠人肾上腺皮质癌模型,观察裸鼠的成瘤率、瘤体的生长曲线。2.处死裸鼠,剥离瘤体,比较各组种植瘤的体积差异,同时解剖裸鼠肝肺组织,观察肝肺的肿瘤转移情况；HE染色镜下观察三组模型种植瘤及肝肺转移瘤的组织学形态。3. RT-PCR、Western blot和免疫组化法检测三组模型瘤体中PCAF的表达水平。4. TUNEL法检测三组模型瘤体组织的肿瘤细胞凋亡水平。结果：1.三组模型的裸鼠成瘤率均为100%；PCAF下调组种植瘤的生长速度明显低于其它两组,于第17天起三组间瘤体的差异有统计学意义(F=5.984,P=0.043)。2.32天后PCAF下调组的瘤体平均体积为(889.08±353.60)mm3,明显小于正常组(1889.04±627.67)mm3和阴性对照组(1750.00±593.52)mm3,差异有统计学意义(F=13.61,P=0.0001)；PCAF下调组的肝肺转移率最低(肺转移率为20%、肝转移率为40%),显著低于正常组和阴性对照组,差异均具有统计学意义(F=11.020, P=0.001; F=9.214, P=0.003)。3.三组模型的瘤体组织学形态均符合恶性肿瘤特征。4. PCAF下调组种植瘤中的PCAF mRNA及蛋白的表达水平较正常组和阴性对照组明显降低(F=11.542, P=0.0013; F=10.113, P=0.002)。5. TUNEL法检测三组模型瘤体组织的肿瘤细胞凋亡率：PCAF下调组的肿瘤细胞凋亡率(21.2%±0.8%)高于正常组(9.7%±0.4%)和阴性对照组(11.5%±1.1%),差异具有统计学意义(F=26.113,P=0.0004)。小结：1.成功构建三组裸鼠人肾上腺皮质癌种植瘤模型。2. PCAF在裸鼠体内保持稳定沉默表达。3. PCAF在体内参与人肾上腺皮质癌的增殖、转移的调控,在肾上腺皮质癌的发生、发展中扮演促癌基因的角色。4.沉默PCAF抑制人肾上腺皮质癌SW-13细胞的体内增殖、转移的能力。第四部分沉默PCAF抑制裸鼠肾上腺皮质癌增殖转移的分子机制研究目的：通过检测三组裸鼠肾上腺皮质癌模型瘤体组织中相关蛋白的表达,探讨沉默PCAF表达抑制癌细胞在体内增殖转移能力的分子机制。方法：应用免疫组织化学法分别检测三组模型瘤体中Ace-H3、PCNA、VEGF、 P53、PUMA、Bax、Bcl-2、Caspase-3、β-catenin及MMP-7蛋白的表达水平,分析沉默PCAF引起抑癌效应的分子机制。结果：1. PCAF下调组组蛋白H3乙酰化水平显著低于正常组和阴性对照组,差异有统计学意义(P=0.024,P=0.027)。2. PCAF下调组PCNA及VEGF蛋白阳性率显著低于正常组和阴性对照组,差异有统计学意义(P=0.038, P=0.046; P=0.042, P=0.049)。3. PCAF下调组P53. PUMA. Bax及Caspase-3蛋白的阳性率高于正常组和阴性对照组,差异有统计学意义(P=0.022, P=0.036; P=0.028, P=0.048; P=0.034,P=0.041); PCAF下调组Bcl-2蛋白的阳性率低于正常组和阴性对照组,差异有统计学意义(P=0.027,P=0.046)。4. PCAF下调组P-catenin及MMP-7蛋白的阳性率低于正常组和阴性对照组,差异有统计学意义(P=0.037, P=0.028; P=0.021, P=0.036)。小结：1.沉默PCAF通过降低组蛋白H3乙酰化水平,引起下游相关靶基因P53、β-catenin表达水平的变化。2.沉默PCAF通过降低PCNA及VEGF的表达,抑制肿瘤细胞的体内增殖、转移能力。3.沉默PCAF通过提高P53、PUMA的表达,激活线粒体凋亡途径(Bax表达升高、Bcl-2表达下降),提高Caspase-3的表达,促进细胞凋亡。4.沉默PCAF通过降低Wnt通路中β-catenin的表达,引起下游靶基因MMP-7表达下降,降低肿瘤细胞的体内侵袭迁移力。全文总结：本研究发现PCAF在人肾上腺皮质癌中呈过表达,是一种促癌基因。在裸鼠人肾上腺皮质癌种植瘤模型中,沉默PCAF表达水平,可以抑制肿瘤细胞在体内的增殖、转移及侵袭迁移的能力,并提高其凋亡水平。从分子机制方面阐述,沉默PCAF可以降低组蛋白H3乙酰化水平,引起下游相关靶基因P53、β-catenin表达水平的变化：激活P53介导的线粒体凋亡途径,促进肿瘤细胞凋亡；抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性,降低下游基因MMP-7的表达,减弱肿瘤细胞的侵袭迁移能力；同时降低PCNA及VEGF表达水平,抑制肿瘤细胞的增殖、转移力。综上所述,PCAF基因可能成为肾上腺皮质癌诊断、治疗和预后的新靶点。