论文部分内容阅读
研究背景下腰痛是现代社会一个困扰人类健康的重要问题,它不仅给患者的工作和生活带来极大的痛苦,而且对社会生产力发展也造成了严重的负影响。背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)作为感觉传入的初级神经元,在下腰痛的发病过程中起重要作用。各种损伤因素导致背根神经节持续受压(chronic compression of dorsal root ganglion, CCD)产生的根性神经痛是下腰痛最常见的致病原因。CCD可以明显提高受损DRG神经元的兴奋性,进而产生自发性疼痛、机械性的异常疼痛和热痛觉过敏,而且伴随着神经元的自发性放电增加,动作电位和电流阂值降低。受压的DRG神经元成为异位放电的来源,即使无交感神经活动或者内源性化学激活物质,仍存在自发性放电。DRG神经元上存在多种可能参与机械刺激传导的离子通道,其中在DRG上广泛分布且高表达的TRPV4(transient receptor potential vanilloid receptor4)离子通道是一种多觉感受器,参与了渗透压和伤害性机械刺激信号的传导。本课题组前期研究发现,CCD可以明显上调受损DRG神经元上TRPV4基因和蛋白的表达,而且证实TRPV4参与CCD导致的机械痛阂和热痛阈。另有研究发现,TRPV4对钙离子和钠离子都有通透性,TRPV4受体激活后引起细胞内钠离子和钙离子浓度的增加,异位放电增加。综合以上研究我们推测,TRPV4可能与受损DRG神经元的异位放电有关。制备CCD模型,观察DRG神经元的持续受压对大鼠行为学的影响,以及随着压迫时间的变化受损DRG神经元组织形态学的改变；采用在体神经纤维电生理技术观察CCD后受损DRG神经元异位放电情况及钉红(ruthenium red, RR)和佛波醇(4α-PDD)对异位放电的影响,明确TRPV4是否参与了CCD后受损DRG神经元的异位放电。研究目的利用在体神经纤维电生理技术记录DRG神经元持续受压后的异位放电情况,明确TRPV4是否参与了CCD后受损DRG神经元的异位放电。研究方法1.异位放电的记录1.1CCD模型的制备采用45只成年健康雄性Wistar大鼠,随机分为正常组(n=5)、CCD组(n=10)、钌红组(n=10)、佛波醇组(n=20)。 CCD组是在大鼠麻醉后,将“U”形钢棒的一端沿L5椎间孔的前壁上方水平插入椎管内,使之挤压L5DRG。正常组不进行任何操作。1.2术后3-8天,利用在体神经纤维电生理技术分别记录大鼠正常组DRG及CCD组、钌红(RR)组、佛波醇(4α-PDD)组受损DRG神经元的异位放电情况。2.神经行为学的测量及DRG神经元形态学观察2.1CCD模型的制备健康雄性Wistar大鼠35只,随机分为空白对照组、手术7天组、手术14天组、手术28天组、假手术7天组、假手术14天组、假手术28天组,每组5只。手术组是在大鼠麻醉后,将“U”形钢棒的一端沿L4及L5椎间孔的前壁上方水平插入椎管内,使之挤压L4和L5DRG神经元。假手术组除不插钢棒压迫神经节外,其余操作同手术组,空白对照组不进行任何操作。分别于术后7天,14天和28天处死动物。2.2神经行为学的测量分别于术前1天及术后不同时期(2天、4天、6天、8天、10天、12天、14天、16天、18天、20天、22天、24天、26天及28天)测量2.2.1动物运动功能(motor function)观察动物自然状态下随意行走的步态,采用记分制：1分=正常步态、足无畸形；2分=正常步态伴明显足畸形；3分=轻度步态障碍伴足下垂；4分=严重步态障碍伴肌无力。2.2.2机械刺痛阈值(Mechanical withdrawal threshold, MWT)和热辐射刺激缩爪反应潜伏期(Thermal withdrawal latency, TWL)的测量MWT的测量使用VonFrey Monofilaments机械痛刺激仪(BME-403型)。将大鼠放进铺有金属网格的透明玻璃箱里,使用各种强度的Von Frey针丝,由低到高刺激动物手术侧足底,缩爪或舔足为阳性反应。每根针丝测量5次,至少能够引发3次缩爪反应的针丝强度即为机械痛阈值。TWL的测量使用热痛刺激仪(BME-410A型),将大鼠放进铺有6mm厚的有机玻璃板的透明玻璃箱里,将热痛刺激仪放在有机玻璃板下方,使光源焦距照射动物后肢足底掌心,电子秒表记录从照射开始到引起后肢回缩反应时的潜伏期作为热痛觉观测指标。2.3DRG神经元组织形态学观察造模后7天、14天、28天取材,HE染色,光镜下观察背根神经节的组织形态学改变。结果1.CCD组可以记录到受损DRG神经元的异位放电,放电率约为67%,而正常组DRG神经元的异位放电率仅为4.5%,两者比较有统计学意义；2.以TRP家族阻断剂RR100μm (?)阵育受损DRG神经元,孵育5-10分钟后,受损DRG神经元的放电开始下降；孵育30分钟后,神经元的放电几乎被完全阻断。较CCD组受损DRG神经元异位放电的频率和波幅均明显下降(n=10,p＜0.05)；3.以TRPV4特异激动剂佛波醇(4a-phobol12,13-didecanoate,4a-PDD)1nm、1μm、10μm的剂量孵育受损DRG。孵育20-30分钟后,与CCD组受损DRG神经元异位放电相比,1nm、1μm4α-PDD组受损DRG神经元异位放电未出现明显变化(both p>0.05);10μm4α-PDD组受损DRG神经元放电频率和波幅均明显增加(n=10,p＜0.05)。4.神经行为学4.1运动功能所有动物在损伤前后步态均正常,足无畸形,评分均为1分,损伤前、后各组间无显著性意义；4.2机械痛阈值和热辐射刺激缩爪反应潜伏期手术前,各组大鼠的机械缩爪阈基础值无差别。持续压迫明显降低大鼠损伤侧的机械痛阈值和热辐射刺激缩爪反应潜伏期,手术组各时间段大鼠右后肢机械痛阈值和热辐射刺激缩爪反应潜伏期的改变具有显著性差异(P＜0.05),空白对照组及各假手术组各时间段的两痛阈值无明显改变；5.HE染色结果显示：术后7天时受损的DRG神经元细胞出现明显组织水肿,间质血管充血,可见炎性细胞浸润；术后14天时受损的DRG神经元的神经外膜和神经纤维水肿明显,间质仍充血,神经元空泡样变性,核固缩,局部大量炎细胞浸润；术后28天时受损DRG神经元的神经外膜水肿减轻,神经内膜增厚,神经元细胞周围纤维结缔组织包绕,少许炎性细胞浸润。而空白对照组及各假手术组背根神经节病理改变不明显。结论CCD明显增加受损DRG神经元的异位放电,TRPV4参与介导了CCD后受损DRG神经元的异位放电。