目前的研究结果表明,脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)后,在其损伤区域开始出现大量不同的轴突生长抑制物质,这些生长抑制物质大致可分为3类：髓磷脂相关抑制物(myelin-associated inhibitor, MAI)、胶质瘢痕起源的抑制物(inhibitory components of the glial scar, ICGS)、斥性轴突导向分子(repulsive axon guidance molecules, RGM)。据报道阻断这些抑制因子将会提高SCI后神经修复效果。越来越多的研究认为,中枢神经损伤后神经元内RhoA的表达及其活化是轴突再生能力低下的主要内因,神经损伤处微环境内的大部分抑制剂分子可以刺激和激活神经元内的RhoA及进一步激活其下游信号通路来抑制神经轴突的生长。由此可见,RhoA在脊髓损伤病理学和再生修复中起着极其重要的作用。RhoA蛋白是一种小分子GTPase,属于Ras超家族中的一员,能结合GDP(无活性)或GTP(有活性),从而发挥其主要的分子开关作用,是所有真核细胞细胞骨架肌动蛋白的调节因子。在哺乳动物神经系统的发育阶段,RhoA表达并参与调节神经元的迁移和突起的伸长,而在成熟神经元中几乎不表达。当神经元损伤后,RhoA表达开始升高,并且能被激活。脊髓损伤后RhoA的重新高表达及其激活可致使轴突生长锥的塌陷。RhoA的高表达和激活还可以引起神经元和胶质细胞凋亡。因此,设法降低受损神经元的RhoA表达或抑制其激活就有可能为促进脊髓损伤修复提供一个新的治疗策略。目前关于脊髓损伤后RhoA的表达变化已有过一些报道,但是存在不同的观点：大部分报道认为损伤脊髓内RhoA表达增加,但是也有人认为脊髓损伤并不会改变RhoA的表达总量。另外,目前关于RhoA在损伤脊髓内表达变化的研究主要只关注了SCI急性或亚急性期的变化情况。到目前为止,具体到RhoA在脊髓损伤后不同时间段、不同部位及不同细胞内的表达变化情况还不清楚。为了探明RhoA在损伤脊髓内的时空表达变化情况,本课题以成年小鼠全横断性脊髓损伤为动物模型,SCI术后存活1,3,7,14,28,56,112天后取材检测了RhoA阳性细胞的分布；RhoA阳性反应物在神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的定位；各种类型细胞中RhoA阳性免疫反应物的荧光强度的变化。为探讨RhoA在脊髓损伤病理变化过程的机制以及今后以RhoA为靶向治疗脊髓损伤提供基础。1.材料与方法1.1脊髓损伤模型的建立昆明小鼠64只,雌性,12周龄,25-35g。实验动物被随机分为假手术组和实验组：正常组(n=8),实验组：术后存活1天、3天、7天、14天、28天、56天和112天(每个时间点n=8)。昆明小鼠称重后,用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,剂量为30mg/kg。正常组在麻醉后于小鼠背侧T10-11位置打开锥板,仅仅暴露脊髓。其他各组则需要在暴露同一位置脊髓后进一步用显微手术剪剪开硬脊膜,于T11位置垂直切除长度为1mm的一段脊髓,完全掏空损伤腔。实验组分别在切除脊髓,查无出血后逐层缝合。常规护理,注射抗生素2周,每天早晚各一次排尿,持续1周。密切观察小鼠的身体和精神状态。1.2组织准备和双荧光免疫组织化学注射1%戊巴比妥钠麻醉,剂量为50mg/kg,用4%多聚甲醛灌注取材,后固定于4℃的4%多聚甲醛过夜。然后移入30%蔗糖溶液中过夜,用OTC包埋后作冰冻切片,用CM1900恒温箱冰冻切片机切片,切片方向分别为脊髓横切和脊髓纵切。横切组织取T9节段和T10节段分别被连续切片,12μm厚。纵切组织取以损伤区为中心长约1.5厘米的脊髓组织,20μm厚,连续切片。最后将所有的切片贴在涂有明胶防脱的载玻片上,储存在-20℃,以备进一步使用。1.3免疫组化用抗体RhoA/NF200, RhoA/GFAP, RhoA/CNPase或RhoA/IBA1将组织切片行免疫组化双染来检测RhoA,以及RhoA阳性反应物在神经元、星形细胞、胶质细胞和小胶质细胞内的表达定位。为了阐明脊髓损伤后RhoA在不同的实质细胞的时间和空间的详细表达变化情况,我们先后对T10段和T9段横截面的RhoA阳性细胞的总数,并对RhoA阳性细胞的在各种细胞中所占比例以及平均免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)荧光强度进行了定量分析。1.4图像分析及统计学分析免疫组化双染所得的图片分别用photoshop和Image-Pro Plus6.0图片处理软件进行各类型的RhoA阳性细胞计数和荧光密度测定,将所得的数据使用SPSS13.0统计分析软件进行单因素重复测量因素的方差分析、单样本t检验和单因素方差分析的方法进行处理。2.结果2.1探讨脊髓损伤后RhoA表达变化情况正常的脊髓只有少数的神经元或胶质细胞微弱地表达RhoA。脊髓损伤后,RhoA表达上调显著,特别是在损伤区附近。损伤后1天,RhoA阳性细胞主要分布在损伤区临近的一个节段内。损伤3天后,RhoA阳性细胞数量显著增加,在距离损伤区远达5个节段的脊髓组织内均可见RhoA阳性细胞的分布。术后7天,RhoA阳性细胞的数量及其阳性强度均达到高峰,随后RhoA阳性细胞的数量及其阳性强度逐渐降低。到术后112天,RhoA阳性细胞主要分布在损伤部位附近2个节段内。通过荧光双染,我们观察到,部分RhoA阳性细胞可定位于神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞。定量计数结果显示RhoA阳性细胞的数量从术后1天到术后7天一直在持续增加,7天时达到高峰,然后逐渐减小,到术后达到了一个相当低的水平。2.2RhoA的表达定位2.2.1神经元内RhoA的表达情况在正常的脊髓中,通过RhoA/NF200双荧光组织化学染色我们观察到RhoA仅在个别神经元内中略微表达。术后1天,RhoA阳性神经元的比例和荧光强度显著提高,7天时达到顶峰。在T10节段,RhoA表达持久,甚至到术后112天时,表达量仍然较多,但T9节段水平在术后56天时表达量几乎与正常组相似,已经没有显著的统计学差异。排除术后1天的RhoA阳性细胞百分比和术后112天的荧光强度值(p>0.05),术后同一时间点相比,T10节段均显著高于T9(p<0.05)。2.2.2胶质细胞中RhoA的表达情况在正常的脊髓中,免疫组化结果显示,只有很少的少突胶质细胞可以检测到非常弱的表达。但在脊髓受损后,各种胶质细胞都有一定量的RhoA表达。星形胶质细胞和少突胶质细胞与神经元内RhoA表达变化的趋势大体一致。术后1天RhoA阳性细胞百分比和荧光强度均增加,7天时达到峰值,然后逐渐下降,并且在各节段内各类细胞比例,没有明显的区别。然而,术后1天--56天期间内,T10节段的荧光强度明显高于T9节段(p<0.05)。与此同时,我们发现RhoA阳性的小胶质细胞与其它细胞的RhoA的表达量是不同的。术后1天,阳性细胞的百分比就已达到较高的水平,14天达到高峰,而荧光强度也达到最大。而后两者比例和强度逐渐下降,但在112天时仍持续在相对较高水平,且明显高于同一时间的其他细胞的表达情况。3.结论创伤不仅可以使脊髓神经元内RhoA表达在数量和强度上的增高,各种胶质细胞也有不同程度的表达增强。在不同时间段,不同部位及不同细胞内RhoA表达均有不同。