【摘 要】
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近年来关于类胡萝卜素裂解双加氧化酶（CCDs）降解类胡萝卜素的机制及其产物的研究取得了较大的进展,其产物是形成香气的重要物质,另外还具有一定的抗炎抑菌活性。虾青素（Astaxanthin）作为类胡萝卜素合成途径的最终产物,抗氧化能力最强,目前人们对CCDs参与的虾青素降解的代谢途径和调控机制尚未见报道。本论文的目的在于筛选到能够裂解虾青素的CCDs,同时探索CCDs对虾青素的作用机制和反应的产物,
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近年来关于类胡萝卜素裂解双加氧化酶（CCDs）降解类胡萝卜素的机制及其产物的研究取得了较大的进展,其产物是形成香气的重要物质,另外还具有一定的抗炎抑菌活性。虾青素（Astaxanthin）作为类胡萝卜素合成途径的最终产物,抗氧化能力最强,目前人们对CCDs参与的虾青素降解的代谢途径和调控机制尚未见报道。本论文的目的在于筛选到能够裂解虾青素的CCDs,同时探索CCDs对虾青素的作用机制和反应的产物,这将首次揭示关于CCDs催化虾青素的功能,其有利于拓宽CCD家族底物谱系、催化作用机制。本论文主要主要包括两个方面的实验,（一）对虾青素具有裂解作用CCDs的预测及筛选;（二）候选CCDs对虾青素裂解作用的功能验证。其中CCDs的筛选及预测流程分为三个步骤:（1）通过Chemhub工具分析虾青素的裂解可能反应途径及产物;（2）使用Selenzyme基于Chemhub的预测结果,对反应途径所需酶进行预测和筛选;（3）获取候选CCDs的氨基酸序列,通过SWISS-MODEL构建蛋白模型,之后与底物虾青素使用Autodock Vina进行分子对接,从而初步验证具有裂解作用的候选CCDs。候选CCDs裂解虾青素裂功能验证包括体外和体内验证:（1）候选CCDs的基因进行原核密码子优化合成,将其构建到原核载体p RSFDuet-1上;（2）通过IPTG诱导重组表达质粒p RSFDuet-1-CCDs蛋白表达,获取粗酶液与虾青素进行体外催化反应,并检测产物;（3）体内验证将产虾青素的重组表达质粒p CBFD1/HBFD1 Bad-p EBTA-ipi与p RSFDuet-1-CCDs共转E.coil TOP10,IPTG和L-Arabinose诱导共表达,并检测产物。本论文的研究结果如下,（1）经生物信息学工具分析,预测到虾青素的裂解途径及产物（4,9-dimethyldodeca-2,4,6,8,10-pentaenedial和17500＿newsyn）,筛选到了来自雨生红球藻（Haematococcus Pluvialis,H.Pluvialis）Hp CCDa、矮牵牛（Petunia hybrida,P.hybrida）Ph CCD1、黑枸杞（Lycium ruthenicum,L.ruthenicum）Lr CCD4、玉米（Zea mays,Z.mays）Zm CCD1 4个候选CCDs;（2）候选CCDs的蛋白模型与CCDs与底物虾青素的虚拟模型分子对接均成功。（4）Ph CCD1、Zm CCD1、Hp CCDa成功在原核宿主中表达蛋白,Lr CCD4未能表达蛋白。虾青素与CCDs原核共表达结果中,LC-MS未检测到预测的两个产物,（5）CCDs与底物虾青素体外验证结果中,Ph CCD1、Zm CCD1与虾青素的体外反应结果中经LC-MS检测到预测的其中一个产物化合物17500＿newsyn（未功能验证）。本研究中借助生物信息工具预测并经实验验证了其裂解产物,成功筛选到了对虾青素具有裂解活性的CCDs,进一步证明生物信息学工具与实验验证结合使用的可行性。另外首次验证虾青素的裂解产物及具有相关活性的CCDs,进一步揭示了类胡萝卜素家族与CCDs家族的作用机制。
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