研究背景及目的糖尿病性骨病在颌骨有骨量减少和骨质疏松的表现,需要接受正畸治疗的糖尿病患者中,Ⅰ型糖尿病青少年患者常因咬合问题和颌骨发育异常就诊,Ⅱ型糖尿病成人患者常因牙周退化和咬合问题就诊。正畸治疗的成功在很大程度上取决于骨的改建能力,正畸力产生的组织反应不仅与牙周、颌骨局部因素有关,也与影响骨代谢的全身因素、激素和细胞因子有关。如何防止糖尿病患者正畸治疗中的骨丧失,促进骨修复重建一直受到口腔正畸学者的关注。糖尿病导致骨代谢异常的机制尚未完全阐明,目前的研究认为骨代谢异常的中心环节是成骨细胞(Osteoblast,OB)功能障碍,高糖(high glucose,HG)可直接抑制OB功能,骨形成受到抑制,钙和维生素D代谢紊乱影响骨转换水平,进而导致骨矿化障碍引起骨代谢异常。应用合适的药物防止高糖对OB功能的损伤,是治疗与骨代谢相关疾病的迫切需要。硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)是一种新型的气体信号分子和细胞保护剂,是继一氧化氮和一氧化碳之后的第三种内源性气体信号分子。现已证明OB(Osteoblast,OB)中存在内源性H2S,生理浓度的增加可促进OB分化,在骨折愈合过程中,H2S可以降低局部炎性细胞浸润并抑制OB中的氧化应激反应的作用,促进骨折的愈合。内源性H2S在牙周韧带细胞(Periodontal ligament cell,PDL)和人牙周膜干细胞(Human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)中也有表达,参与正畸力力学信号的传导,有助于牙周干细胞的成骨分化,对牙周组织和正畸牙齿移动中软硬组织的改建发挥重要作用。有学者进一步研究发现,H2S异常代谢与骨代谢缺陷有关,提示如果能在动物体内提供有效无毒的H2S供体,有可能治疗因H2S缺乏而引起的骨质疏松症等疾病。机体各个系统及组织中内源性H2S的产生的作用及生理病理机制正在不断揭示,随着对外源性H2S的合成、供体的研究不断深入,H2S有着广阔的治疗性应用前景,使用外源性H2S或其供体,在控制一些疾病的发生及发展方面正在发挥其积极的作用。ATP敏感钾离子通道(ATP-sensitivepotassiumchannel,KATP)是最早报道的H2S生物学效应靶分子,H2S能通过与心肌细胞、血管平滑肌细胞、胰腺β细胞、肠胃平滑肌细胞、神经元上的KATP作用,产生调节心肌收缩力、血管紧张度、胰岛素分泌、肠胃平滑肌收缩、神经递质传递等效应,并且H2S还能通过KATP产生抗炎、抗凋亡等细胞保护作用。研究发现KATP与机体骨的形成密切相关,KATP影响骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨分化,调节OB的增殖,作为离子通道,KATP维持骨细胞的膜电位并可能参与骨细胞的机械敏感性及细胞间通讯。非兴奋细胞OB也存在KATP通道,但外源性H2S是否通过效应分子KATP通道影响OB的功能目前尚未见报道。本实验以培养大鼠下颌骨原代成骨细胞(Primary osteoblast,POB)为研究对象,应用分子生物学和细胞生物学技术,首先检测外源性H2S是否通过其效应分子KATP参与调节HG诱导的OB损伤,其次检测外源性H2S通过KATP通道对高糖诱导的OB功能的影响,包括细胞增殖、凋亡、矿化的分析和成骨分化相关信号分子ALP、collaI、Runx2及OSX基因的表达,本研究目的在于观察外源性H2S-KATP通道对OB分化过程中的表达变化及功能的影响,进一步探求KATP在OB分化中的作用,并初步研究分析其作用机制,寻找能调控或干扰OB功能、加速受损OB修复的新方法,以期为外源性H2S促进糖尿病患者骨的修复重建提供一定的理论基础,为骨代谢病的防治提供新线索和实验依据。研究方法1、大鼠下颌骨POB的分离培养及鉴定在无菌条件下,取出大鼠乳鼠的下颌骨,采用酶消化法-组织块法联合培养,从骨片中获取原代细胞,待细胞长满培养瓶后传代。对细胞进行形态学观察,并利用血细胞计数板对细胞进行计数,绘制生长曲线。用碱性磷酸酶钙钻法和茜素红染色法对培养的细胞进行OB生化特性鉴定。2、观察硫化氢及高糖干预后OB的KATP通道的表达变化选择3-5代生长旺盛,性质稳定的成骨细胞进行实验。将细胞按实验分组(1)对照(control)组:DMEM 培养基(5.5mmol·L-1DMEM)处理OB,30 min;(2)高糖(HG)组:HG(26.5 mmol·L-1 DMEM)处理 OB30 min;(3)硫化氢钠(NaHS,为H2S的供体)组:NaHS(400μmol·L-1)处理成骨细胞30min,撤去,PBS洗2次,接着DMEM培养基处理30 min;(4)NaHS+HG组:NaHS作用OB30min,撤去,PBS洗2次,接着用HG处理30 min;提取总蛋白和RNA,采用定量Western Blot和RT-PCR方法测定KATP的蛋白及基因的表达。3、检测硫化氢及KATP通道在高糖介导下对OB的增殖、凋亡、矿化及成骨分化相关信号分子的表达变化选择3-5代生长旺盛,性质稳定的成骨细胞进行实验。将细胞按实验分组(1)control;(2)HG;(3)NaHS;(4)NaHS+HG;(5)格列本脲(KATP 通道阻断剂 glibenclamide,Gli)组:Gli(0.01 μmol·L-1)作用成骨细胞30 min,撤去,PBS洗2次,接着DMEM培养基处理30 min;(6)Gli+NaHS+HG组:Gli作用成骨细胞30min,撤去,PBS洗2次,后续实验步骤与第(4)实验组相同;(7)吡拉地尔(KATP通道开放剂pinacidil,Pin)组:Pin(0.1μmol·L-1)作用成骨细胞30 min,撤去,PBS洗2次,接着DMEM培养基处理30min;(8)Pin+HG组:Pin作用成骨细胞30min,撤去,PBS洗2次,接着HG处理30 min;(9)Pin+NaHS+HG:Pin作用成骨细胞30 min,撤去,PBS洗2次,后续实验步骤与第(4)实验组相同;分别用流式细胞仪检测细胞的凋亡,CCK8及EDU方法检测细胞增殖,茜素红染色分析检测细胞矿化,并用RT-PCR的方法检测成骨分化相关信号分子碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,ALP),骨桥蛋白(osteopotin,OPN),Runt 相关转录因子2(runt-related transcript factor 2,Runx2),成骨细胞特异性转录因子(osterix,OSX)的表达变化。研究结果1、成功分离、培养、鉴定POB。镜下观察,细胞呈三角形、纺锤形和多角形等多种形态,传代培养成骨细胞状态良好,细胞长满瓶底时,呈梭形或立方形,排列紧密。从细胞生长曲线观察,第2-3天开始快速生长,第7-8天达生长高峰,数目达到峰值后增长速度逐渐减慢,进入平台期细胞数量开始下降,细胞停止增殖并出现细胞调亡。经碱性磷酸酶钙钴法染色和茜素红染色鉴定阳性,细胞具有OB的特性。2、H2S减弱HG对OB的KATP通道蛋白及基因的抑制作用。免疫印迹分析表明,KATP表达在HG组有明显的抑制作用,NaHS+HG组KATP表达明显高于HG组(P<0.01),KATP通道蛋白的表达量在HG影响下减少,而NaHS减弱HG对KATP的表达抑制。RT-PCR结果说明,KATP基因的表达量在HG影响下明显减少,而NaHS减弱HG对KATP基因的表达抑制。3、H2S通过KATP通道调节HG抑制的OB增殖,凋亡。HG对OB增殖具有明显的抑制作用,KATP阻断剂Gli对OB增殖的抑制作用与HG对OB的增殖抑制作用类似,NaHS与KATP通道开放剂Pin的作用类似,对OB的增殖增加比较明显,结果有统计学意义(P<0.01)。当用Gli阻断KATP通道,凋亡细胞数量显著增加(P<0.01),而KATP开放剂Pin对细胞凋亡的影响与control相比无明显影响,在NaHS和Pin加入后与HG相比,细胞凋亡明显减少,结果有统计学意义(P<0.01)。4、H2S通过KATP调节OB分化及骨形成相关基因的表达,促进成骨细胞的分化;H2S对HG诱导的OB矿化减少有抑制作用,但抑制作用与KATP通道无关。HG明显抑制OB的ALP、OPN,Runx2和OSX基因表达(P<0.01)。用NaHS处理,ALP的增强不明显,但OPN,Runx2和OSX的表达与control相比明显增强,结果有统计学意义(P<0.05)。HG对Runx2、OSX的抑制作用被NaHS明显减弱(P<0.01),导致OB分化及骨形成相关基因表达增加。HG处理后的OB矿化量明显降低(P<0.01),同时NaHS预处理对HG导致的OB矿化减少有抑制作用NaHS预处理能增加OB的矿化量,然而,Gli或Pin对OB矿化的与contal相比较影响不显著(P>0.05),表明KATP通道与成骨细胞的矿化无关。研究结论1、外源性H2S通过KATP通道拮抗高糖引起的成骨细胞损伤,对成骨细胞有保护作用;2、外源性H2S可作为成骨细胞的KATP通道开放剂;3、外源性H2S通过KATP通道拮抗高糖诱导的成骨细胞的增殖减少、凋亡增加和分化减少,但与HG导致的成骨细胞的矿化减少无关。