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早期国内分离的J亚群禽白血病病毒主要引起肉鸡骨髓瘤病变,但近年来从国内新出现并逐渐流行的临床“血管瘤”病例发病鸡体内经常可以分离到J亚群病毒。
为了解血管瘤相关ALV-J分离株的致病性,本研究以国内首次分离的血管瘤病变型J亚群禽白血病病毒SCAU-HN06株为亲本毒,通过反向遗传技术,成功构建并获救具有感染性的病毒粒子。获救病毒可被ALV-J特异性单克隆抗体JE9所识别,感染细胞后生长曲线表明获救克隆毒与亲本分离毒复制能力接近。获救病毒在细胞培养上清中的滴度为105.8TCID50/0.2mL。将亲本毒与获救克隆毒分别以104TCID50/枚的剂量经尿囊腔途径接种11日龄SPF自来航鸡胚,亲本毒组和获救克隆组分别在第16、17周开始出现明显的血管瘤病变,至30周龄时这两组血管瘤发病率分别为(13/25,52％;9/21,42.8％),未感染组无肿瘤发生。血管瘤多发生在胸部、腿部、颈部、翅膀及爪部皮下,肝脏血管瘤也较为常见。病理组织切片证明,血管内皮细胞增生、形成许多小血管,有的瘤组织血管中有血栓形成。以上结果证明,分离自血管瘤发病鸡的ALV-J分离株是使感染鸡群产生此病变表型的病原。利用巢式PCR对患肿瘤鸡组织中前病毒插入原癌基因的相对位置检测结果表明,患肿瘤鸡中分别有(7/9,78％)和(1/9,11％)的前病毒基因组插入到了宿主原癌基因c-erbB和c-myc附近。
为了研究E元件在血管瘤病变型ALV-J致病性中的作用,构建并获救E元件缺失的突变体病毒rSCAU-HN06-ΔE。该缺失病毒仍可被ALV-J特异性单克隆抗体JE9所识别,且体外增殖性能稳定。其在细胞水平的复制能力略低于亲本毒。将亲本克隆毒与缺失克隆毒分别以104TGID50/枚的剂量经尿囊腔途径接种11日龄SPF白来航鸡胚,缺失病毒所引起的感染鸡血清学状态较亲本毒复杂,虽然缺失毒仍可以使感染的SPF鸡产生血管瘤,但产生率有所降低,rSCAU-HN06组为42.8％(9/21),rSCAU-HN06-ΔE组为35％(7/20)。以上结果表明,E元件并不是ALV-J复制的必需序列,但它在一定程度上影响病毒的复制能力与致病性。
对不同ALV-J分离株的序列分析中发现,多株血管瘤病变型ALV-J的Leader序列中都有一段相同的19bp的插入,该段序列在已报道的ALV-J序列中未被发现过。为了研究该19bp在血管瘤病变型ALV-J致病性中的作用,对该19bp进行缺失,构建并获救缺失的突变体病毒rSCAU-HN06-(-19)。该病毒在细胞水平的复制能力与亲本毒相似。将亲本克隆毒与缺失克隆毒分别以104TCID50/枚的剂量经尿囊腔途径接种11日龄SPF自来航鸡胚,缺失病毒所引起的感染鸡血清学状态较单一,以S+V+A-为主,SCAU-HN06-(-19)感染组肿瘤产生率与rSCAU-HN06感染组相接近40％(8/20),不同的是皮下血管瘤与内脏肿瘤并存情况所占比例升高,占总体肿瘤产生率的50％(4/8)。
对可诱导不同病变型禽白血病的ALV-J LTR进行序列分析,结果显示血管瘤病变型ALV-J SCAU-HN06株与国内外骨髓瘤病变型参考株LTR核苷酸序列相似性为88％～91.1％,而各骨髓瘤病变型参考株之间LTR苷酸序列相似性高达91.7％～97.2％,这说明近年来分离的血管瘤病变型ALV-J与国内外早期分离ALV-J LTR核苷酸相似性较远,其核苷酸序列存在一定的特殊性;基于LTR核苷酸序列构建的系统进化树结果表明血管瘤病变型ALV-J SCAU-HN06株与其它骨髓瘤病变型ALV-J处于不同的分支。SCAU-HN06株LTR中的U5、R区与国内外参考株相比保守性较高,分别为90.0％～93.8％,100％。而U3区却存在着较大的变异,相似性仅为86.3％～88.9％。但U3区的各个转录因子结合位点序列都十分保守。本研究以不同病变型相关ALV-J LTR作为启动子构建重组质粒,以CAT表达量来评价LTR启动子活性。结果表明,SCAU-HN06株LTR启动子活性略高于骨髓瘤病变型ALV-J(JHN株,NX0101株),但差异不显著。
本研究还分别将血管瘤病变型ALV-J SCAU-HN06株的LTR和env基因序列替换成骨髓瘤病变型ALV-J JHN株、NX0101株相应序列,获得嵌合突变毒rSCAU-NX-LTR、rSCAU-JHN-LTR、rSCAU-NX-env和rSCAU-JHN-env,分别以104TCID50/枚的剂量经尿囊腔途径接种11日龄SPF白来航鸡胚,感染鸡呈现以S+V+A-型为主的感染状态。LTR序列替换的嵌合毒所引起的肿瘤类型与致瘤率与亲本毒接近,env序列被替换的嵌合毒所导致的血管瘤病变型产生率明显降低(1/20,5％),说明env基因序列在血管瘤病变型ALV-J致病性中起主要作用。
为对ALV-J感染后所导致免疫及肿瘤相关基因转录水平变化进行初步探索,本研究用实时荧光定量PCR方法在ALV-J感染DF-1细胞后24h、48h、72h、120h和168h对细胞因子及肿瘤相关基因mRNA转录水平进行测定。结果显示ALV-J感染导致DF-1细胞Tert转录水平升高;VEGF的mRNA转录水平无明显变化;CD4、CD8、c-myb转录水平先降低后升高;TNF、VEGFR、EGFR转录水平先升高后降低;PTPRO 波动升高,但升高幅度不大;c-myc、CD3在检测时间点成波动趋势无明显规律。