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目的:利用C57BL/6小鼠建立毛发生长的动物模型,研究小鼠毛囊周期中毛囊周围微血管系统的变化、血管新生现象以及血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况(变化)。
材料和方法:
(1)取24只6~8周龄,皮色粉红,毛发处于休止期的雌性C57BL/6小鼠,用松香/蜡(1:1)混合物脱毛诱导背部毛囊同步性进入新的毛发生长周期。
(2)分别于脱毛后的O,3,5,8,12,17,19,25天在紧靠皮肤平滑肌下方的皮下组织水平切取小鼠背部皮肤(每个时点上三只小鼠)。部分组织制成石蜡切片,进行抗CD31(显示血管内皮细胞)、抗VEGF免疫酶染色;部分组织制成冰冻切片,进行抗CD31/Ki-67双重免疫荧光标记(显示增殖性血管内皮细胞)。
(3)利用MoticMed6.0CMIAS数码医学图像分析系统和抗CD31染色小鼠皮肤切片,观察、测量毛囊周围微血管系统形态学上的变化(排列、血管直径、微血管密度);利用抗CD31/Ki-67双重免疫荧光标记的冰冻切片,计数增殖性内皮细胞数;利用抗VEGF染色小鼠皮肤切片,观察VEGF的表达部位(变化)。
(4)所有的统计分析在SPSS¨.5统计软件上实现,P<0.05有统计学差异。
结果:
(1)毛囊周围的皮肤微血管系统在小鼠毛囊周期中有显著的结构变化。脱毛后0天(休止期)的血管主要位于真皮的近端和皮下组织中,且排列紧密,沿毛囊纵向走行的血管较少。相比之下,在脱毛后12天(生长期Ⅵ亚期)沿毛囊纵向走行的血管很多。脱毛后0天的血管内皮细胞细胞核小、扁平、狭长,脱毛后12天的血管内皮细胞细胞核则较大、呈卵圆形。
(2)脱毛后O天与脱毛后12天相比较,后者皮下组织中的血管平均直径较大(P<0.001)。
(3)微血管密度(MVD)自脱毛后O天(休止期)起一直增加,并且直到脱毛后25天(此时所有的毛囊都己进入休止期)未见显著下降。MVD在生长期发展中不断升高,尤以从生长期II亚期(脱毛后3天)到生长期Ⅳ亚期(脱毛后5天)明显。
(4)大量的增殖性内皮细胞(PECs)只能在生长期检测到。在休止期(脱毛后0天)和生长期早期(脱毛后3天)未见到PECs。生长期Ⅳ亚期(脱毛后5天)到生长期V亚期(脱毛后8天)PECs有统计学意义上的增加(p<0.001),而在生长期V亚期(脱毛后8天)与生长期Ⅵ亚期(脱毛后12天)之间(p<0.001)、生长期Ⅵ亚期(脱毛后12天)与脱毛后17天(退行期)之间PECs有统计学意义上的降低(p<0.001)。脱毛后17天(退行期)与生长期Ⅳ亚期(脱毛后5天)之间PECs数目没有统计学意义上的差别。
(5)在整个毛发生长周期中真皮网状层和皮下组织中的VEGF免疫活性主要位于毛囊外毛根鞘的上皮细胞,毛乳头仅在生长期的早期和中期产生VEGF。在毛发生长周期中,许多真皮和皮下组织中的动脉、细动脉、毛细血管也具有VEGF免疫反应性。
结论:
(1)毛囊周期毛囊周围的微血管系统结构以及排列有显著的变化。主要表现有:生长期比休止期相比,毛囊间有更多的血管,血管内皮细胞核呈卵圆形(后者的血管内皮细胞核扁平);皮下血管的平均直径大;有更高的微血管密度,等等。
(2)只有生长期才有大量的增殖性血管内皮细胞。
(3)休止期到生长期毛囊周围微血管系统的变化是血管新生的表现。
(4)外毛根鞘的上皮细胞是真皮网状层和皮下组织中VEGF的主要来源。