免疫胶体金技术在鸭坦布苏病毒和快速定量检测Asial型口蹄疫病毒的应用

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胶体金免疫层析技术(ImmunochromatographicAssay, ICA)是在抗原和抗体特异反应的基础上并结合免疫层析分析技术和胶体金标记技术,用胶体金标记物作为探针,通过胶体金颗粒的颜色放大免疫反应系统,使其结果直接显示在固相载体上的一项新型体外检测技术。它具有结果判定快速、操作简便,标本用量少、试剂稳定、便于保存等优点。广泛应用于临床诊断。本文分别研制了鸭坦布苏病毒免胶体金疫层析试纸条和快速定量检测口蹄疫Asia1型病毒胶体金免疫层析试纸条,并对试纸条的性能行进了研究。主要内容有以下几个部分:1.建立鸭坦布苏病毒胶体金免疫层析试纸条方法鸭坦布苏病毒病是坦布苏病毒(Duck tembus Virus, DTMUV)引起的是以鸭产蛋下降和死亡为主要特征的传染病。2010年春天,在上海首先暴发。该病不知道来源。得病的鸭高烧、食欲下降、生长迟缓、产蛋率下降甚至导致死亡。并且迅速传播到中国的东南部所有的省份,包括浙江、江苏、福建、安徽等地。到了冬天该病并没有得到缓解。持续传播到了山东、河南、湖南、湖北、江西。此病发病急,传播迅速。发病对象主要为麻鸭。商品肉鸭也可被感染。DTMUV的检测主要是病毒分离和分子生物学检测。这些方法过程繁多,操作复杂,检测时间长,成本高,而且还需要专业的设备和技术人员,不适合田间样品的检测。本研究利用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,鸭坦布苏病毒制备的多克隆抗体分别作为胶体金标记捕获抗体和硝酸纤维素膜上检测抗体,分别喷涂于玻璃纤维与硝酸纤维素膜,制备形成鸭坦布苏病毒胶体金试纸条。结果显示:该试纸条与禽流感和新城疫无交叉反应。本试验对于敏感性、稳定性和对田间样品的检测未做详细的实验,是试验验中的不足,还需要进一步的研究来完善,从而使其更好的应用于临床。2.建立快速定量检测口蹄疫Asia1型病毒胶体金免疫层析试纸条方法口蹄疫病(Foot-and-Mouth Disease,FMD)由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth DiseaseVirus, FMDV)引起的侵害牛、猪、羊等多种偶蹄动物感染的急性、热性和高度接触性传染病。其大规模流行给畜牧业生产和进出口贸易造成巨大经济损失,快速而准确地诊断该病,已成为口蹄疫防控技术研究的重要问题。FMD病原学诊断方法主要有病毒分离鉴定、间接夹心ELISA和RT-PCR等方法要求有熟练的试验操作人员、特定的试验室和专用仪器设备,因而检测费用高。本研究采用胶体金为标记物制备了快速定量检测Asia1型FMD病毒免疫层析试纸条,拟合检测曲线,用金标分析仪进行定量检测。应用实验室与田间的样品检测证实其有较好的敏感性和特异性。对Asia1型FMD病毒抗原定量检测可以在15min内完成,灵敏度为0.78μg/mL,线性范围在0.78~7.84μg/mL;变异系数在0.2%~5%;回收率在91%~102%,证明定量检测准确度高。
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