血管性痴呆（vascular dementia，VD）是指由缺血性卒中、出血性卒中和造成记忆、认知和行为等脑区低灌注的脑血管疾病所致的严重认知功能障碍综合征。血管性痴呆患者随着病情加重，最终会丧失正常工作生活的能力，随着我国人口老龄化，缺血性脑卒中的发生率逐年上升，血管性痴呆带来的社会及家庭危害也逐年增大。　　尽管预防卒中目前已经有充分的手段，控制行为和精神症状也有相应的药物，但在已经发生认知功能障碍的患者人群中，现有药物改善认知功能效果不佳，我们急需探讨新的血管性痴呆治疗新方法。　　近年来一些相关研究发现，人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)分泌营养因子的独特作用能更好的诱导微血管形成，提高神经及血管内皮修复功能。hUC-MSCs移植到缺血性卒中模型体内改善了神经功能缺损并减少了梗死面积。hUC-MSCs的内皮细胞分化潜能也得到证实，它可分化为血管内皮细胞并增加VEGF的表达。hUC-MSCs经侧脑室移植后可迁移到缺血处脉管系统，部分可分化为内皮细胞，移植治疗后增加了缺血半球血管密度,促进血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）和成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）的表达，hUC-MSCs移植促进缺血性卒中功能恢复，可能与其促进血管新生有关。hUC-MSCs通过提高血管密度调节血管系统的重建，通过促进血管生长，可以增加脑血流，改善缺血组织损伤。　　本课题设计采用双侧颈内动脉永久结扎法制作大鼠脑缺血低灌注性血管性痴呆模型，分离纯化并培养人脐带间充质干细胞，侧脑室注射荧光标记的人脐带间充质干细胞，观察移植后间充质干细胞存活及迁移。Morris水迷宫法检测大鼠的学习能力，行为学评价观察大鼠脑血管性痴呆模型认知功能改善的效果。组织免疫化学观察神经元的变化，血管新生的情况，星形胶质细胞的变化。磁共振观察大鼠的脑组织结构的变化，以及血流灌注的变化，并利用核磁共振血流灌注分析细胞移植治疗后的血管性痴呆模型是否能够形成血管重建，并从功能上改善缺血脑组织的灌注。　　第一部分 血管性痴呆大鼠模型的制作与鉴定　　方法：（1）脑缺血低灌注性血管性痴呆模型：参照Wakita等的方法制备慢性脑缺血的血管性痴呆大鼠改良2VO模型。2%戊巴比妥（45mg/kg）腹腔注射麻醉，大鼠仰卧位固定，常规消毒，颈部正中切开皮肤，暴露病分离双侧颈总动脉，丝线结扎。假手术组只进行麻醉和血管分离术，不结扎颈总动脉。（2）水迷宫筛选造模成功的大鼠：a、定位航行训练实验：模型组大鼠29只与假手术组大鼠8只，术后第21天开始训练，每天上午9-10时和下午3-4时各训练1次，连续4天，记录大鼠从入水到找到平台的时间。b、空间探索实验：第5天撤去平台，记录大鼠从入水到第一次到达平台位置的时间（潜伏期）及60秒内有效停留时间和穿越平台次数，作为衡量其空间学习记忆能力的检测指标。对大鼠进行筛选，计算每只大鼠在5天内找到平台的平均时间。以假手术组大鼠潜伏期的均值作为参考值，计算各模型大鼠的平均潜伏期与参考值之差占该鼠的平均潜伏期时间的比例，作为筛选指标对模型大鼠进行筛选。2VO模型制作后2天行3D T1WI,轴位T2Flair，DWI序列观察脑组织形态，模型术后4周行颈部3D TOF MRA扫描观察血流状态。　　结果：造模成功大鼠和假手术组大鼠，术中没有因为麻醉或手术而死亡，1只大鼠出现颈部大血肿，影响进食和活动，剔除该大鼠，3周后模型大鼠及假手术组大鼠行为学实验结果：定位航行实验中，随着训练次数增加，模型组到达平台时间与假手术组相比明显延长（P＜0.05）。空间探索实验中，与假手术组相比，模型组第一次到达平台时间显著延长（P＜0.05），且在目穿越平台次数和目标象限的停留时间也明显减少（P＜0.05）。行为学实验筛选出造模成功大鼠23只。2VO模型制作后2天行3D T1WI,轴位T2Flair，DWI序列未发现明显脑梗死病灶，4周后进行颈部MRA检查发现造模成功大鼠双侧颈动脉血流阻断，远端血流减少。　　结论：大鼠2VO模型,4周后影像学证实大鼠双侧颈总动脉血流被永久性阻断。经影像学和行为学鉴定，该方法制作的大鼠模型，没有急性脑梗死病灶，4周后仍存在确定的血流减少，并且存在认知功能的减退，可以获得稳定的低灌注性血管性痴呆大鼠模型。　　第二部分 人脐带间充质干细胞培养鉴定及移植大鼠模型　　方法：（1）无菌条件下取得脐带，采用组织贴壁培养方法，分离脐带间充质干细胞，以贴壁培养法进行原代培养，传代接种并纯化，倒置显微镜下观察生长状态和形态学变化，并进行细胞表面标志物鉴定。将提纯的细胞制备成细胞浓度为3×106/100ul细胞悬液。（2）用脑立体定位技术将BrdU标记的脐带间充质干细胞移植到大鼠侧脑室中。分别在术后2，4，8d荧光显微镜下观察BrdU标记的脐带血间充质干细胞在脑内的生存和迁移情况。　　结果：倒置显微镜下原代培养的细胞4天后出现大量以间充质为主的贴壁细胞，混杂大量其他细胞，形态成纺锤形或梭形，传代后的细胞完全贴壁。这些细胞经免疫组化鉴定，均表达间充质细胞的标志物CD29,CD44,CD90,而造血细胞系的表面标志物CD34阴性。经立体定位侧脑室移植后，细胞移植后,荧光显微镜观察，移植后第2天染色细胞集中在注射的右侧侧脑室，移植后第4天染色细胞迁移至侧脑室周围，移植后第8天染色细胞迁移到皮质区。　　结论：取自产妇的脐带经细胞分离，原代培养和传代培养后，增殖能力及活力良好，形态一致，表达间充质细胞标志物，不表达造血细胞标志物，分离纯化后纯度高,移植的间充质干细胞可在大鼠脑组织中存活，并向脑组织内迁移。　　第三部分 细胞移植治疗后血管性痴呆大鼠脑组织病理及灌注改变　　方法：大鼠分为四组：（1）CO（假手术组)：8只，仅分离双侧颈总动脉，步骤同第一部分。（2）2VO（模型组）：7只，永久性结扎大鼠双侧颈总动脉，步骤同第一部分。（3）UC-MSCs组：8只，对永久性结扎双侧颈总动脉后造模成功的血管性痴呆大鼠，经侧脑室注射人脐带间充质干细胞。（4）PBS组：8只，对永久性结扎双侧颈总动脉后造模成功的血管性痴呆大鼠，经大鼠侧脑室注射磷酸缓冲液PBS。于注射细胞或PBS后三周行水迷宫行为学实验，4周行核磁共振检查，选取每只大鼠的海马区域半自动勾画双侧感兴趣区，计算并比较各组的脑血流量（cerebral blood flow,CBF）值。第35天，处死大鼠，进行脑组织固定，对照组，假手术组，UC-MSCs组，PBS对照组四组大鼠，CD34免疫染色观察血管密度。GFAP染色观察星形胶质细胞。　　结果：定位航行实验中：2VO模型组到达平台时间与假手术组相比明显延长（P＜0.05）。与2VO模型组相比，UC-MSCs组达到平台时间明显缩短（P＜0.05）。空间定位实验中：2VO模型组与假手术组相比潜伏期明显延长（P＜0.01）,平台区域有效停留时间明显缩短（P＜0.05），穿越平台次数明显减少（P＜0.01）。UC-MSCs组与2VO模型组相比，第一次到达平台潜伏期明显缩短（P＜0.05），平台区域停留时间明显延长，穿越平台次数明显曾加（P＜0.05）。HE染色显示：2VO组大鼠海马锥体细胞数目较假手术组明显减少，形态欠规则，细胞皱缩，细胞带分布不均，甚至出现脱失和中断，注射PBS组与模型组相似，与模型组及PBS组相比，注射干细胞组病理损伤减轻。与假手术组大鼠相比，2VO组大鼠海马组织中GFAP阳性的活化的星形胶质细胞显著增多，UC-MSCs组与2VO模型组相比，降低了星形胶质细胞的活化。2VO组CD34阳性细胞数比CO(假手术组)显著增加（P＜0.05）,UC-MSCs组CD34阳性细胞计数与2VO模型组相比较有统计学差异（P＜0.05）。UC-MSCs组的rCBF左侧与右侧相比有显著统计学差异（P＜0.05），PBS组的rCBF值双侧无显著统计学差异（P＞0.05）,缺血的2VO模型组与假手术组相比，双侧rCBF值均有显著的统计学差异（P＜0.01），PBS组及UC-MSCs组与2VO模型组相比，双侧海马区域rCBF均无显著统计学差异（P＞0.05）。　　结论：UC-MSCs细胞移植后血管性痴呆模型的空间辨识能力能够得到显著改善。影像学检查提示可见2VO模型组缺血后双侧海马区域均有明显低灌注。大鼠移植细胞侧的血流灌注情况较对侧有明显改善。在组织形态学方面UC-MSCs细胞移植后神经元凋亡破坏减少，星形胶质细胞活化减少，新生血管单元明显增多。