细胞接受机械力（包括摩擦力、压力、牵引力、重力和剪切力等）信号并对机械力做出反应的生物学过程称为机械力信号传导。不管是真核生物还是原核生物,细胞都会受到机械力的影响并对机械力产生一定的应答。生物体内部保持着静态或动态的力学相互作用,例如在血液流动时会产生剪切力,肌肉伸缩时会产生拉伸力。同时外在力学环境也对生命状态造成影响,例如宇航员进入太空后在失重的状态下会发生骨损失的现象。此外,机械力也可以引发人体产生一系列物理变化甚至疾病。例如,二尖瓣疾病与多种力敏感性活性分子相关,如细胞外成分、机械力传导原件、细胞质和核转录因子。骨疾病（强直性脊柱炎,腕管综合征,慢性背痛,椎间盘退变）通常由于破骨细胞和成骨细胞对骨的分解和形成出现了平衡偏差,这种平衡偏差主要由遗传异常或者机械力传导异常所致。再如,血管细胞产生形态变化会对血管的生理状态产生深远影响,引发血管疾病,如动脉粥样硬化和血栓形成。因此,机械力信号传导机制的研究对于人类健康具有重要意义。从细胞生物学角度,机械力信号传导对机械力敏感的细胞的生长、分化和存活有重要影响。例如,幼稚间充质干细胞会在软硬不同的基质上分化成不同类型的组织。当前,细胞如何感受和传递机械力并调控基因表达的分子机制仍不清楚。目前研究进展表明,机械及化学机制均参与了信息由胞外向染色体的传递过程,机械信号途径由细胞外基质、细胞骨架、核骨架构成。该结构体系支配着细胞和细胞核的形态,在细胞外周与核内染色质之间建立了结构与功能的联系,在细胞周期及基因表达中起到了一定的作用。化学信号机制,利如MAPK/Ras途径能够激活多种激酶,调节转录因子、组蛋白、非组蛋白活性;同时也能改变染色体结构和基因表达。因此,机械和化学调节机制并非独立,二者相互影响。为了对细胞机械力信号传导的分子机制进行深入研究,这篇论文在两部分中分别用自顶向下和自底向上两种方法筛选和鉴定新型力敏感性分子。在第一部分中,本论文尝试利用SILAC技术（细胞培养中的同位素标记技术）结合质谱分析开发一种新型的自底向上的鉴定转录相关因子的方法。通常作用于细胞膜的物理或生化信号可以激活转录因子,转录因子可以聚集在其作用位点并激活细胞特异性的基因表达过程。该过程必不可少的一步就是转录因子由细胞质到细胞核的运输以及反式作用因子在DNA的结合。当前,已经有一些蛋白分子作为核质穿梭分子被相继报导。YAP/TAZ已被鉴定为非常保守的机械传导器。YAP/TAZ可接收外界如剪切力和细胞外基质硬度等多种机械应力信号,并将机械力信号翻译到细胞特异性转录程序。研究表明,当细胞在较硬的基质上生长以及没有受到接触抑制时,YAP/TAZ在细胞核中。而当细胞在较软的基质上生长或受到接触抑制时,YAP/TAZ在细胞质中。但就YAP/TAZ的穿梭机制,科学家们还未完全研究清楚。有观点认为YAP/TAZ受Hippo信号通路调控:当细胞受力时,Hippo通路处于未激活状态,此时未磷酸化的YAP/TAZ在细胞核内并参与细胞生长的基因调控;当细胞处于失力状态时,Hippo通路激活,此时被磷酸化的YAP/TAZ出核进入细胞质中,并被蛋白酶体消化。还有观点认为,机械应力的施加会使细胞核孔变大从而引发YAP的进核。不同于核质穿梭的转录因子如YAP在调控基因表达时有明显的定位区别（细胞核或细胞质）。反式作用因子可以一直存在与细胞核中并直接或间接地识别或者结合顺式作用元件的核心序列,从而参与调控基因转录效率,对基因表达产生激活或阻遏的作用。之前研究还表明,染色质上存在有脱氧核糖核酸酶的超敏位点,大量转录调控元件附着在脱氧核糖核酸酶的超敏位点,因此利用脱氧核糖核酸酶对染色质进行消化可实现对结合于转录调控元件上的反式作用因子的提取。由于当前细胞机械力信号传导的机制仍不清楚,新型参与基因调控的相关因子的发现有助于细胞机械力信号传导机制的研究。SILAC技术结合质谱分析可以实现定量的蛋白质组学研究,从而发现参与基因调控的核质穿梭分子以及反式作用因子。SILAC技术是指在细胞培养过程中,用含有同位素标记的氨基酸(如L-Arginine,L-Lysine和¹³C₆-L-Lysine,¹³C₆¹⁵N₄-L-Arginine)的完全培养基进对细胞行连续不断的传代培养,使细胞内所有蛋白中的该氨基酸充分得到交换。随后对其中一组细胞进行机械力刺激作为实验组,与对照组混合后进行质谱分析,通过比较蛋白样品中轻重氨基酸的比率筛选核质穿梭的转录因子或存在于细胞核中的反式作用因子。近年来,SILAC技术被广泛应用于蛋白质组学。与传统蛋白质组学相比,细胞培养中的同位素标记技术具有适用范围更广,检测结果更准,样品制备更为简便和稳定等优点。本课题组首先尝试利用SILAC技术结合质谱分析发现新型具有力敏感性的转录相关因子。首先,我们先后对小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠胚胎干细胞、大鼠间充质干细胞以及人骨骼肌细胞进行了轻重氨基酸(L-Arginine,L-Lysine和¹³C₆-L-Lysine,¹³C₆¹⁵N₄-L-Arginine)的标记并用质谱测得了人骨骼肌的标记效率,认为标记结束后的细胞可用于蛋白质组学的分析。其次,我们尝试开发一种提取核蛋白或反式作用因子的方法。我们最先利用商品化试剂盒分离细胞核并检测YAP,但是试剂盒分离细胞核中YAP的效果并不理想,大部分YAP被检测到存在于细胞质中。因此,我们尝试利用低渗溶液结合去污剂如Triton X-100和NP-40开发不同的方法分离细胞核,但发现大量YAP仍会存在于细胞质组分。随后我们发现在低渗溶液中加入一定浓度的糖如D型甘露醇可以有效调节溶液渗透压,在分离细胞器的过程中使更多YAP留在细胞核中;同时我们还用脱氧核糖核酸酶处理细胞核组分并分离得到更多可溶性反式作用因子。最近一次蛋白质谱结果表明,我们成功鉴定出了一些已知的机械力敏感的转录因子,因此我们相信质谱数据中存在其他新型的机械力敏感的转录调控因子。再次,机械应力不同的生物模型的构建是实现机械力信号传导研究的前提和基础。该研究中用到两种不同的生物机械应力模型。一是在培养过程中利用blebbistatin处理细胞以模仿细胞失去内部收缩力的状态,从而模拟细胞在软培养基质或悬浮状态下生长。二是用构建硬度不同的聚丙烯酰胺凝胶作为细胞培养基质以探索干细胞在硬度不同的培养基质上的分化机制。聚丙烯酰胺凝胶可以通过调整丙烯酰胺和双叉丙烯酰胺的浓度实现硬度的不同。由于凝胶的制备周期较短,硬度可调节范围较广,因此聚丙烯酰胺凝胶被广泛应用于细胞基质硬度的研究。本课题成功制得小鼠胚胎成纤维细胞以及大鼠间充质干细胞可贴壁的培养基质,并用已知的转录因子YAP进行验证,发现在较硬（40Kpa）凝胶上YAP定位在细胞核中,而在较软（3Kpa）基质上YAP定位在细胞质中,该现象与已有报导一致。因此我们可以将聚丙烯酰胺凝胶构建的基质应用于基于软硬基质不同发现转录相关蛋白因子的研究中。最后,本研究中核质穿梭的转录因子或反式作用因子的初步确定依靠免疫荧光和细胞转染的方式实现。考虑到在免疫荧光实验中,商品化抗体是否满足所有候选分子的局限性以及抗体定位由于非特异性结合出现偏差的可能性,我们计划同时用细胞转染的方法对候选核质穿梭分子进行进一步验证。发现重组构建的pc DNA3-YAP-Myc以及pc DNA3-YAP-HA的实验组与对照组定位存在差异并于免疫荧光定位差异一致。因此,pc DNA3-Myc和pc DNA3-HA两个蛋白表达载体被初步认为可以用于对候选核质穿梭转录因子的验证。本课题当前初步鉴定出WBP2（WW domain-binding protein 2）是机械力敏感的穿梭分子,并认为在得到的质谱结果中,存在更多新型机械力敏感的转录因子或反式作用因子。论文第二部分介绍一种通过自顶向下的方法发现的新型力敏感性的细丝蛋白A的结合蛋白并命名为fimbacin。细丝蛋白A是一种编码于X染色体的蛋白质,是细丝蛋白家族中含量最多,分布最广的蛋白质。细丝蛋白A和纤维状肌动蛋白交联后,可以与大量的结合配体包括受体、信号分子甚至转录因子相互作用。细丝蛋白A基因的突变和缺失会抑制细丝蛋白A的正常表达并造成许多先天性异常疾病。细丝蛋白A的结构为:由N-端类血影蛋白的肌动蛋白结合域起始,并与24个类免疫球蛋白（lg FLN或者R）的重复片段相连,最终两条长链通过第24重复序列的C末端二聚化形成二聚体。细丝蛋白A和超过100个结合配体在Rod-2区域进行相互作用,这个区域有独特的几何形状和简单的结构,可以通过构象的改变调节其与配体的相互作用并对机械力产生应答,将机械力转化为生化信号。本课题组通过之前的研究发现细丝蛋白A通过第21重复片段对整合素暴露并进行机械信息的感受和传导。首先,我们探究了是否有其他的生物分子与第21重复片段的隐藏结合位点相结合。利用蛋白质组学和对细丝蛋白A结合基序的计算机模拟分析,我们发现了一种编码于LUZP1基因上的可以与细丝蛋白A结合的蛋白,并命名为fimbacin.Fimbacin不与细丝蛋白A的全长结合,但与细丝蛋白A上隐藏的与整合素结合的位点相互作用。我们发现细丝蛋白A上与fimbacin相结合的两个结合位点,并鉴定出决定其相互作用的氨基酸残基。其次,通过成束反应实验可以发现fimbacin本身也是肌动蛋白的交联蛋白,与肌动蛋白的结合位置在400-500氨基酸残基。同时fimbacin通过氮端的结构域形成低聚物（从分子排阻色谱可以得出fimbacin可形成八聚体）并作为卷曲螺旋蛋白与肌动蛋白相交联。再次,我们通过免疫荧光共定位发现fimbacin与细丝蛋白A的相互作用不会影响fimbacin是否与肌动蛋白结合。但在荧光漂白恢复实验中,我们发现对照组的恢复时间最长,运动分量最低。并由此得出结论:删掉结合位点的突变型细丝蛋A减少了fimbacin与肌动蛋白纤维的结合;通过使Rho激酶失活抑制细丝蛋白A第21重复片段的打开以消除fimbacin和细丝蛋白A的相互作用,也减少了fimbacin和肌动蛋白纤维的结合。因此fimbacin与细丝蛋白的结合稳定了fimbacin与肌动蛋白的结合。综合表明fimbacin可以与细丝蛋白A第21重复片段结合同时也是肌动蛋白的交联蛋白。