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[目的]
高血压血管重构主要包括血管壁增厚、血管壁腔比增高和小动脉的稀少，随之产生血管功能异常，导致心、脑、肾这些重要脏器功能衰竭。因此，深入研究高血压血管重构的防治机制，具有重要意义。目前大量实验研究证明，肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)在血管重构的形成和病理进展中发挥重要作用。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是RAAS的主要效应物质，可通过多种途径介导血管重构的形成。已有研究表明，AngⅡ在血管中的多种作用是由NADPH氧化酶衍生的ROS通过激活多个信号分子介导的，其中包括磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路。大川芎方是临床早期调整脏腑的阴阳气血，逆转高血压靶器官损伤的基础方剂，且副作用小、经济、安全，但其对高血压血管重构的改善机制不明确，成为限制其进一步研究开发和临床应用的瓶颈。那么，大川芎方改善高血压血管重构是否通过抑制氧化应激、炎症和PI3K/Akt以及MAPK信号通路发挥作用，是本研究拟解决的主要问题。因此，在前期工作的基础上，探讨大川芎方对AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖、迁移和炎症改变及自发性高血压大鼠(SHR)血管重构的干预效应及可能机制，主要明确大川芎方对VSMCs中PI3K/Akt以及MAPK信号通路异常活动的调控作用，以及对高血压大鼠的血管重构是否具有防治作用。
[方法]
1.离体实验选用VSMCs细胞株进行，采用AngⅡ(100nmol/L)来诱导血管平滑肌细胞损伤模型。分组为:空白对照组、含药血清组、AngⅡ组、AngⅡ＋含药血清组。CCK-8法和Westernblot法检测各组细胞增殖能力，Transwell检测细胞迁移能力，ELISA法检测炎症因子MCP-1、VCAM-1、IL-1β表达，DHE荧光检测超氧阴离子水平，比色法检测细胞内NADPH活性，Westernblot法检测P-Akt和P-ERK等蛋白表达。
2.选用12周龄雄性无特定病原体级(SPF级)SHR大鼠40只和Wistar-Kyoto(WKY)大鼠10只，随机分为:空白对照组(WKY组)、模型组(SHR组)、SHR+苯磺酸氨氯地平(SHR-Norvasc)、SHR+大川芎方低剂量组(SHR-L)、SHR+大川芎方高剂量组(SHR-H)。连续用药干预六周，1次/日。给予等体积的蒸馏水灌胃空白对照组以及模型组。干预前测量血压一次，干预开始后每周测量血压一次。干预六周后取材，HE染色法观察血管形态结构变化并计算血管壁厚度(WT)；天狼星红染色法观察血管周围纤维化程度；ELISA法检测炎症因子MCP-1、VCAM-1、IL-1β表达；Westernblot法检测P-Akt和P-ERK等蛋白表达。
[结果]
1.细胞实验结果：
1)大川芎方含药血清对VSMCs的细胞毒性影响。结果显示，不同浓度(5%，10%，15%，20%，25%)大川芎方含药血清对VSMCs活力的影响没有显著性差异(P＞0.05)。说明大川芎方含药血清对VSMCs无明显毒性作用。
2)大川芎方含药血清对VSMCs活力的影响。各组VSMCs与相应干预措施作用24h后，结果显示，AngⅡ组细胞活力显著高于空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)；AngⅡ+25%含药血清组细胞活力明显低于AngⅡ组(P＜0.01)。取浓度为25%的含药血清作为后续实验条件。
3)大川芎方含药血清可以抑制AngⅡ诱导的VSMCs迁移。结果显示：AngⅡ处理24h后，经室迁移的VSMCs数量显著增加(P＜0.01)，大川芎方含药血清预孵育24h后VSMCs迁移明显受到抑制(P＜0.01)，提示大川芎方含药血清抑制AngⅡ诱导的VSMCs迁移。
4)大川芎方含药血清可以抑制AngⅡ诱导的VSMCs炎性因子表达。结果显示：与空白组相比AngⅡ刺激24h后VSMCs中MCP-1、VCAM-1、IL-1β表达明显升高(P＜0.01)，而大川芎方含药血清预孵育24h后MCP-1、VCAM-1、IL-1β表达较AngⅡ组显著下降(P＜0.01)，提示大川芎方含药血清抑制AngⅡ诱导的VSMCs炎性因子表达。
5)大川芎方含药血清可以抑制AngⅡ诱导的VSMCs中ROS生成。DHE荧光结果显示：与空白组相比，AngⅡ刺激VSMCs24h后，细胞内的红色荧光强度显著增强，可以说明超氧阴离子的生成明显增多(P＜0.01)，大川芎方含药血清干预AngⅡ刺激的VSMCs，细胞内的红色荧光强度明显减弱，接近正常水平(P＜0.01)；比色法结果显示：VSMCs中NADPH氧化酶活性也在AngⅡ处理VSMCs中增强，经大川芎方含药血清预处理24h后显著降低(P＜0.01)。提示大川芎方含药血清降低AngⅡ诱导的VSMCs中NADPH氧化酶活性和ROS产生。
6)大川芎方含药血清可以抑制AngⅡ诱导的P-Akt和P-ERK1/2蛋白表达。结果显示：与空白组相比，VSMCs经AngⅡ刺激24h后，P-Akt和P-ERK1/2的蛋白表达显著增强(P＜0.01)，而总ERK1/2(t-ERK1/2)和总Akt(t-Akt)蛋白水平不受AngⅡ影响(P＞0.05)；大川芎方含药血清预处理VSMCs24h显著抑制AngⅡ诱导的Akt和ERK1/2的蛋白磷酸化表达水平(P＜0.01)。提示大川芎方含药血清抑制AngⅡ诱导的Akt和ERK1/2蛋白磷酸化水平。
2.动物实验结果：
1)大川芎方可降低SHR大鼠动脉血压。与WKY组相比，SHR组大鼠收缩压显著升高(P＜0.01)；与SHR组相比，三个治疗组6周治疗结束后血压均显著下降(P＜0.01)；与大川芎方低剂量组相比，大川芎方高剂量组和氨氯地平组效果更佳。说明一定剂量大川芎方可以降低高血压大鼠的动脉血压。
2)大川芎方逆转自发性高血压大鼠肠系膜动脉血管重构。HE染色结果显示：灌胃治疗6周后，WKY组大鼠肠系膜动脉形态大致正常，各层均都较薄，内膜光滑，中膜含4-8层平行的平滑肌纤维，无肥大增生，外膜无增厚；SHR组出现血管重构表现，管壁显著增厚，管腔狭窄，可见中层VSMCs排列紊乱，外膜增厚明显且细胞增生；各治疗组与SHR组相比血管重构表现有不同程度改善，其中SHR-Norvasc组、SHR-L组管壁略变薄，管腔狭窄轻微减轻，SHR-H组管壁增厚、管腔狭窄现象明显减少，且内膜较光滑，外膜增厚不明显。通过对各组大鼠肠系膜动脉血管壁定量分析发现，与WKY组相比，SHR组肠系膜动脉WT明显增高(P＜0.01)，差异有统计学意义；各治疗组分别与SHR组相比，SHR-Norvasc组、SHR-L组WT降低(P＜0.05)，SHR-H组WT明显降低(P＜0.01)。提示大川芎方高剂量可以逆转血管重构。
3)大川芎方改善自发性高血压大鼠血管周围纤维化。天狼星红染色结果显示：灌胃治疗6周后，与WKY组相比SHR组肾脏血管周围纤维化显著增加，与SHR组相比SHR-Norvasc和SHR-L组轻微减轻了肾脏血管周围纤维化，而SHR-H组肾脏血管周围纤维化显著减轻。用ImageJ图片分析软件计算纤维化面积，以及肾脏血管周围纤维化增长百分比，结果表明：各治疗组较SHR组肾脏血管周围纤维化程度有所改善(P＜0.05，P＜0.01)；WKY组纤维化程度与SHR-H组比较无差异(P＞0.05)。提示大川芎方高剂量可改善自发性高血压大鼠血管周围纤维化。
4)大川芎方降低肠系膜动脉中炎症因子表达。结果显示：灌胃治疗6周后检测各组大鼠肠系膜动脉中MCP-1、VCAM-1和IL-1β的表达，与WKY组相比SHR组MCP-1、VCAM-1、IL-1β表达明显升高(P＜0.01)，各治疗组肠系膜动脉中MCP-1、VCAM-1、IL-1β表达均有不同程度较下降(P＜0.05，P＜0.01)，提示大川芎方高剂量可以显著抑制肠系膜动脉中炎症因子表达。
5)大川芎方可以抑制自发性高血压大鼠肠系膜动脉中P-Akt和P-ERK1/2蛋白水平。结果显示：与WKY组相比SHR组Akt和ERK1/2的磷酸化水平明显升高(P＜0.01)，然而，SHR组总ERK1/2(t-ERK1/2)和总Akt(t-Akt)蛋白水平没有影响；各治疗组不同程度抑制自发性高血压大鼠Akt和ERK1/2磷酸化(P＜0.01)，但大川芎方高剂量组作用显著(P＜0.01)。实验表明大川芎方高剂量对自发性高血压大鼠Akt和ERK1/2蛋白磷酸化水平具有显著抑制作用。
[结论]
1.大川芎方可通过降低ROS介导的Akt和ERK的磷酸化水平，抑制AngⅡ诱导VSMCs的增殖和迁移。
2.大川芎方可通过降低肠系膜动脉炎症因子水平、以及抑制肠系膜动脉Akt和ERK的磷酸化水平，改善自发性高血压大鼠的肠系膜动脉血管壁厚度和管腔狭窄，以及，发挥逆转高血压血管重构作用。
高血压血管重构主要包括血管壁增厚、血管壁腔比增高和小动脉的稀少，随之产生血管功能异常，导致心、脑、肾这些重要脏器功能衰竭。因此，深入研究高血压血管重构的防治机制，具有重要意义。目前大量实验研究证明，肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)在血管重构的形成和病理进展中发挥重要作用。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是RAAS的主要效应物质，可通过多种途径介导血管重构的形成。已有研究表明，AngⅡ在血管中的多种作用是由NADPH氧化酶衍生的ROS通过激活多个信号分子介导的，其中包括磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路。大川芎方是临床早期调整脏腑的阴阳气血，逆转高血压靶器官损伤的基础方剂，且副作用小、经济、安全，但其对高血压血管重构的改善机制不明确，成为限制其进一步研究开发和临床应用的瓶颈。那么，大川芎方改善高血压血管重构是否通过抑制氧化应激、炎症和PI3K/Akt以及MAPK信号通路发挥作用，是本研究拟解决的主要问题。因此，在前期工作的基础上，探讨大川芎方对AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖、迁移和炎症改变及自发性高血压大鼠(SHR)血管重构的干预效应及可能机制，主要明确大川芎方对VSMCs中PI3K/Akt以及MAPK信号通路异常活动的调控作用，以及对高血压大鼠的血管重构是否具有防治作用。
[方法]
1.离体实验选用VSMCs细胞株进行，采用AngⅡ(100nmol/L)来诱导血管平滑肌细胞损伤模型。分组为:空白对照组、含药血清组、AngⅡ组、AngⅡ＋含药血清组。CCK-8法和Westernblot法检测各组细胞增殖能力，Transwell检测细胞迁移能力，ELISA法检测炎症因子MCP-1、VCAM-1、IL-1β表达，DHE荧光检测超氧阴离子水平，比色法检测细胞内NADPH活性，Westernblot法检测P-Akt和P-ERK等蛋白表达。
2.选用12周龄雄性无特定病原体级(SPF级)SHR大鼠40只和Wistar-Kyoto(WKY)大鼠10只，随机分为:空白对照组(WKY组)、模型组(SHR组)、SHR+苯磺酸氨氯地平(SHR-Norvasc)、SHR+大川芎方低剂量组(SHR-L)、SHR+大川芎方高剂量组(SHR-H)。连续用药干预六周，1次/日。给予等体积的蒸馏水灌胃空白对照组以及模型组。干预前测量血压一次，干预开始后每周测量血压一次。干预六周后取材，HE染色法观察血管形态结构变化并计算血管壁厚度(WT)；天狼星红染色法观察血管周围纤维化程度；ELISA法检测炎症因子MCP-1、VCAM-1、IL-1β表达；Westernblot法检测P-Akt和P-ERK等蛋白表达。
[结果]
1.细胞实验结果：
1)大川芎方含药血清对VSMCs的细胞毒性影响。结果显示，不同浓度(5%，10%，15%，20%，25%)大川芎方含药血清对VSMCs活力的影响没有显著性差异(P＞0.05)。说明大川芎方含药血清对VSMCs无明显毒性作用。
2)大川芎方含药血清对VSMCs活力的影响。各组VSMCs与相应干预措施作用24h后，结果显示，AngⅡ组细胞活力显著高于空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)；AngⅡ+25%含药血清组细胞活力明显低于AngⅡ组(P＜0.01)。取浓度为25%的含药血清作为后续实验条件。
3)大川芎方含药血清可以抑制AngⅡ诱导的VSMCs迁移。结果显示：AngⅡ处理24h后，经室迁移的VSMCs数量显著增加(P＜0.01)，大川芎方含药血清预孵育24h后VSMCs迁移明显受到抑制(P＜0.01)，提示大川芎方含药血清抑制AngⅡ诱导的VSMCs迁移。
4)大川芎方含药血清可以抑制AngⅡ诱导的VSMCs炎性因子表达。结果显示：与空白组相比AngⅡ刺激24h后VSMCs中MCP-1、VCAM-1、IL-1β表达明显升高(P＜0.01)，而大川芎方含药血清预孵育24h后MCP-1、VCAM-1、IL-1β表达较AngⅡ组显著下降(P＜0.01)，提示大川芎方含药血清抑制AngⅡ诱导的VSMCs炎性因子表达。
5)大川芎方含药血清可以抑制AngⅡ诱导的VSMCs中ROS生成。DHE荧光结果显示：与空白组相比，AngⅡ刺激VSMCs24h后，细胞内的红色荧光强度显著增强，可以说明超氧阴离子的生成明显增多(P＜0.01)，大川芎方含药血清干预AngⅡ刺激的VSMCs，细胞内的红色荧光强度明显减弱，接近正常水平(P＜0.01)；比色法结果显示：VSMCs中NADPH氧化酶活性也在AngⅡ处理VSMCs中增强，经大川芎方含药血清预处理24h后显著降低(P＜0.01)。提示大川芎方含药血清降低AngⅡ诱导的VSMCs中NADPH氧化酶活性和ROS产生。
6)大川芎方含药血清可以抑制AngⅡ诱导的P-Akt和P-ERK1/2蛋白表达。结果显示：与空白组相比，VSMCs经AngⅡ刺激24h后，P-Akt和P-ERK1/2的蛋白表达显著增强(P＜0.01)，而总ERK1/2(t-ERK1/2)和总Akt(t-Akt)蛋白水平不受AngⅡ影响(P＞0.05)；大川芎方含药血清预处理VSMCs24h显著抑制AngⅡ诱导的Akt和ERK1/2的蛋白磷酸化表达水平(P＜0.01)。提示大川芎方含药血清抑制AngⅡ诱导的Akt和ERK1/2蛋白磷酸化水平。
2.动物实验结果：
1)大川芎方可降低SHR大鼠动脉血压。与WKY组相比，SHR组大鼠收缩压显著升高(P＜0.01)；与SHR组相比，三个治疗组6周治疗结束后血压均显著下降(P＜0.01)；与大川芎方低剂量组相比，大川芎方高剂量组和氨氯地平组效果更佳。说明一定剂量大川芎方可以降低高血压大鼠的动脉血压。
2)大川芎方逆转自发性高血压大鼠肠系膜动脉血管重构。HE染色结果显示：灌胃治疗6周后，WKY组大鼠肠系膜动脉形态大致正常，各层均都较薄，内膜光滑，中膜含4-8层平行的平滑肌纤维，无肥大增生，外膜无增厚；SHR组出现血管重构表现，管壁显著增厚，管腔狭窄，可见中层VSMCs排列紊乱，外膜增厚明显且细胞增生；各治疗组与SHR组相比血管重构表现有不同程度改善，其中SHR-Norvasc组、SHR-L组管壁略变薄，管腔狭窄轻微减轻，SHR-H组管壁增厚、管腔狭窄现象明显减少，且内膜较光滑，外膜增厚不明显。通过对各组大鼠肠系膜动脉血管壁定量分析发现，与WKY组相比，SHR组肠系膜动脉WT明显增高(P＜0.01)，差异有统计学意义；各治疗组分别与SHR组相比，SHR-Norvasc组、SHR-L组WT降低(P＜0.05)，SHR-H组WT明显降低(P＜0.01)。提示大川芎方高剂量可以逆转血管重构。
3)大川芎方改善自发性高血压大鼠血管周围纤维化。天狼星红染色结果显示：灌胃治疗6周后，与WKY组相比SHR组肾脏血管周围纤维化显著增加，与SHR组相比SHR-Norvasc和SHR-L组轻微减轻了肾脏血管周围纤维化，而SHR-H组肾脏血管周围纤维化显著减轻。用ImageJ图片分析软件计算纤维化面积，以及肾脏血管周围纤维化增长百分比，结果表明：各治疗组较SHR组肾脏血管周围纤维化程度有所改善(P＜0.05，P＜0.01)；WKY组纤维化程度与SHR-H组比较无差异(P＞0.05)。提示大川芎方高剂量可改善自发性高血压大鼠血管周围纤维化。
4)大川芎方降低肠系膜动脉中炎症因子表达。结果显示：灌胃治疗6周后检测各组大鼠肠系膜动脉中MCP-1、VCAM-1和IL-1β的表达，与WKY组相比SHR组MCP-1、VCAM-1、IL-1β表达明显升高(P＜0.01)，各治疗组肠系膜动脉中MCP-1、VCAM-1、IL-1β表达均有不同程度较下降(P＜0.05，P＜0.01)，提示大川芎方高剂量可以显著抑制肠系膜动脉中炎症因子表达。
5)大川芎方可以抑制自发性高血压大鼠肠系膜动脉中P-Akt和P-ERK1/2蛋白水平。结果显示：与WKY组相比SHR组Akt和ERK1/2的磷酸化水平明显升高(P＜0.01)，然而，SHR组总ERK1/2(t-ERK1/2)和总Akt(t-Akt)蛋白水平没有影响；各治疗组不同程度抑制自发性高血压大鼠Akt和ERK1/2磷酸化(P＜0.01)，但大川芎方高剂量组作用显著(P＜0.01)。实验表明大川芎方高剂量对自发性高血压大鼠Akt和ERK1/2蛋白磷酸化水平具有显著抑制作用。
[结论]
1.大川芎方可通过降低ROS介导的Akt和ERK的磷酸化水平，抑制AngⅡ诱导VSMCs的增殖和迁移。
2.大川芎方可通过降低肠系膜动脉炎症因子水平、以及抑制肠系膜动脉Akt和ERK的磷酸化水平，改善自发性高血压大鼠的肠系膜动脉血管壁厚度和管腔狭窄，以及，发挥逆转高血压血管重构作用。