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2型糖尿病严重危害人类健康,其主要特征是胰岛素抵抗以及胰岛β细胞的功能减退。2型糖尿病与肥胖密切相关,肥胖状态下胰腺组织发生慢性低度炎症,大量巨噬细胞浸润到胰腺组织并释放大量炎症因子,进一步损伤胰岛细胞功能。因此,巨噬细胞与胰岛细胞之间的相互作用对2型糖尿病的发生发展非常关键。有研究表明丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)参与糖脂毒性(GP)诱导的胰岛细胞炎症反应并对胰岛功能产生影响,其主要包括细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun N端激酶(JNK)蛋白激酶、和P38 MAPKs。MAPK作为细胞内重要的信号通路,在细胞分化、增殖、癌变、凋亡和炎症反应等诸多细胞过程中发挥调节作用。近来有研究发现,丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶5(MKP5)可通过调控MAPK通路缓解肥胖状态下胰岛β细胞的功能紊乱与凋亡,且对GP刺激下脂肪组织中巨噬细胞的炎症反应存在调控作用,但是MKP5是否在糖脂毒性作用下巨噬细胞与胰岛细胞的相互作用过程中发挥调节作用尚未明确。实验目的:本研究通过构建MKP5过表达的巨噬细胞系(RAW-MKP5)以及胰岛细胞系(MIN6-MKP5),探究在GP作用下MKP5对胰岛β细胞与巨噬细胞相互作用所产生的影响,并初步探讨其相关分子机制。实验方法:1.用重组质粒pc DNA3.1-MKP5分别转染巨噬细胞RAW264.7和胰岛细胞MIN6,以G418筛选获得MKP5稳定过表达细胞系,分别命名为RAW-MKP5和MIN6-MKP5。对照组细胞转染pc DNA3.1质粒,筛选后分别命名为RAW-PC和MIN6-PC。2.探究GP作用下MKP5在RAW264.7巨噬细胞中过表达对MIN6细胞凋亡、功能障碍、炎症反应、内质网应激、氧化应激及MAPK通路激活等方面的影响。采用Transwell小室,将RAW-PC和RAW-MKP5细胞分别与MIN6细胞共培养12 h,GP处理12 h,用Western blot法和Real-time PCR法检测MIN6细胞中凋亡相关蛋白cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3、PARP,胰岛功能相关基因PDX-1、GCK,炎性细胞因子IL-1β、IL-6,趋化因子MCP-1,内质网应激相关指标XBP-1s、GRP-94、CHOP、BIP,氧化应激相关指标HIF-1α、PHD3及MAPK家族成员P38、JNK、ERK的表达及活化情况;通过GSIS法检测葡萄糖刺激下MIN6细胞中胰岛素分泌情况;用ROS检测试剂盒检测MIN6细胞中活性氧的变化。另一方面,GP处理RAW-PC和RAW-MKP5细胞12 h,取其上清作为条件培养基分别处理MIN6细胞16 h,利用同样方法检测上述指标变化。3.MKP5在MIN6胰岛细胞中过表达对RAW264.7细胞的影响。利用Transwell小室,将MIN6-PC和MIN6-MKP5细胞分别与RAW264.7细胞共培养12 h,GP处理12 h,Real-time PCR法检测RAW264.7细胞中炎性细胞因子IL-1β、IL-6和趋化因子MCP-1的表达水平。实验结果:1.构建MKP5稳定过表达细胞系与各自对照组相比,RAW-MKP5和MIN6-MKP5细胞中MKP5的表达量都显著升高,说明MKP5稳定过表达的胰岛细胞系和巨噬细胞系构建成功。2.MKP5在RAW264.7细胞中过表达对MIN6细胞的凋亡以及功能的影响Western blot检测凋亡相关蛋白表达,结果显示与RAW-PC细胞共培养使MIN6细胞中GP诱导的Caspase-9、Caspase-3活化增强以及PARP表达下降更为明显,而与RAW-MKP5细胞共培养使MIN6细胞中上述指标的变化趋势得到明显缓解。此外,RAW-PC细胞加重了GP导致的MIN6细胞功能障碍,进一步降低了MIN6细胞的胰岛素分泌水平,但是RAW-MKP5细胞可以使共培养的MIN6细胞的胰岛素分泌抑制显著缓解。与RAW-PC细胞共培养的MIN6细胞中胰岛功能相关基因PDX1和GCK表达明显降低,而与RAW-MKP5细胞共培养的MIN6细胞中二者的表达下降明显缓解。进一步检测条件培养基处理的MIN6细胞中以上指标变化,结果显示PAW-PC细胞条件培养基处理的MIN6细胞中Caspase-9、Caspase-3活化增强以及PARP表达下降,胰岛素分泌水平降低,PDX1和GCK表达明显降低。而RAW-MKP5条件培养基处理的MIN6细胞中上述指标的变化趋势得到缓解。由此,MKP5在RAW264.7巨噬细胞中过表达可缓解相互作用条件下MIN6胰岛细胞的凋亡以及功能紊乱。3.探究MKP5在RAW264.7细胞中过表达对MIN6胰岛细胞的内质网应激、氧化应激和炎症反应的影响与对照组相比,GP明显上调MIN6细胞中炎性细胞因子IL-1β、IL-6,趋化因子MCP-1及内质网应激相关指标CHOP、BIP、XBP-1s、GRP-94的表达。与RAW-PC细胞共培养进一步提高MIN6细胞中以上指标的表达水平。而RAW-MKP5可明显缓解共培养条件下的MIN6细胞中以上指标的高表达。除此,与RAW-PC细胞共培养加剧GP诱导的MIN6细胞中ROS的大量生成,而RAW-MKP5细胞可显著抑制共培养条件下MIN6细胞中ROS的产生。Real-time PCR结果显示,RAW-PC细胞可使共培养条件下MIN6细胞中氧化应激相关指标HIF-1α表达升高,PHD3的表达降低。而RAW-MKP5细胞可明显缓解共培养条件下的MIN6细胞中上述两个指标的变化趋势。RAW-PC细胞条件培养基处理的MIN6细胞中内质网应激相关指标CHOP、BIP、XBP-1s、GRP-94表达上升,氧化应激相关指标HIF-1α表达升高,PHD3的表达降低。RAW-MKP5条件培养基处理的MIN6细胞中上述指标的变化趋势得到明显缓解。综上,MKP5在RAW264.7巨噬细胞中过表达可缓解相互作用条件下MIN6胰岛细胞的炎症反应、内质网应激和氧化应激,从而间接影响MIN6细胞的凋亡以及功能紊乱。4.MKP5在RAW264.7巨噬细胞中过表达对MIN6细胞的MAPK通路的影响Western blot检测JNK、P38、ERK的活化情况。结果显示,GP可激活MIN6细胞中P38、JNK和ERK信号通路。与RAW-PC细胞共培养可使MIN6细胞中p P38、p JNK和p ERK的表达水平进一步升高。MKP5在巨噬细胞中过表达明显抑制共培养条件下MIN6细胞中JNK和P38的活化,而不影响ERK通路。进一步检测条件培养基处理的MIN6细胞中以上指标的活化情况,结果显示RAW-PC细胞条件培养基处理的MIN6细胞中p P38、p JNK和p ERK的表达水平明显升高,RAW-MKP5细胞条件培养基处理的MIN6细胞中p P38、p JNK的表达水平明显下降,p ERK的表达水平不受影响。由此,MKP5可能通过调控JNK和P38信号通路间接改善相互作用下MIN6细胞的凋亡和功能紊乱。5.MKP5在MIN6胰岛细胞中过表达对共培养条件下RAW264.7巨噬细胞细胞中炎症反应的影响在GP刺激下,RAW264.7细胞中炎症因子IL-1β、IL-6以及趋化因子MCP-1的表达水平明显升高。相较于单独培养的RAW264.7细胞,与MIN6-PC细胞共培养的RAW264.7中IL-1β、IL-6和MCP-1的表达量显著增加。相比之下,与MIN6-MKP5细胞共培养的RAW264.7细胞中上述炎性细胞因子的高表达均受到显著抑制。以上结果显示,MKP5在MIN6细胞中过表达可以缓解共培养条件下RAW264.7巨噬细胞的炎症反应。实验结论:1.MKP5通过抑制内质网应激、氧化应激损伤和炎症反应,缓解糖脂毒性刺激下胰岛细胞和巨噬细胞相互作用过程中胰岛细胞的功能紊乱以及凋亡,并抑制胰岛细胞中P38和JNK MAPK通路的活化。2.MKP5可缓解糖脂毒性作用下胰岛细胞和巨噬细胞相互作用过程中巨噬细胞的炎症反应。创新点:MKP5参与调节肥胖相关巨噬细胞和胰岛细胞的相互作用过程。