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背景 糖尿病（Diabetes mellitus,DM）是以高血糖为特征的一类常见代谢性疾病。临床研究表明DM会导致男性生殖功能受损,但DM损伤男性性腺功能的机制尚不完全清楚。褪黑素（Melatonin,MT）作为重要的抗氧化剂靶向线粒体,对自噬和线粒体自噬也有调节作用,MT在DM、肥胖等导致的代谢性损伤中的保护作用逐渐引起重视。沉默信息调节因子1（Sirtuin 1,SIRT1）是一种依赖NAD+的去乙酰化酶,在许多代谢和生理过程中起重要作用,SIRT1与MT在DM相关生殖损害中的作用值得进一步研究。目的 探究SIRT1通路调节线粒体生物合成和线粒体自噬在DM引起睾酮合成功能损伤及MT保护效应中的作用机制。方法 雄性SD大鼠20只,随机分为对照组、糖尿病组、MT处理组和胰岛素处理组。腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）建立Ⅰ型DM模型。造模成功后,分别采用MT和胰岛素处理。取大鼠睾丸组织切片观察形态学变化,提取总蛋白进行Western blot分析SIRT1通路蛋白、睾酮合成相关蛋白/酶、线粒体功能相关蛋白及自噬相关蛋白。体外实验采用小鼠睾丸间质细胞系（TM3）,分为对照组、高糖组和MT处理组。采用si RNA敲低Sirt1基因,研究SIRT1对MT对抗高糖损伤的影响。为研究高糖背景下MT上调SIRT1的机制,MT处理组预先加入抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）处理,以探究MT对SIRT1的调节和对线粒体自噬、线粒体合成的影响与活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平关系。DCFH-DA探针检测TM3细胞中ROS变化;Mito SOX检测线粒体活性氧（Mitochondrial reactive oxygen species,m ROS）产生水平;MDC染色检测自噬小体形成;免疫荧光标记线粒体自噬水平;JC-1荧光探针检测线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）;Mito Tracker标记线粒体的数量和形态;Western blot检测各组TM3细胞中睾酮合成相关蛋白/酶、自噬及线粒体自噬相关蛋白、线粒体生物合成相关蛋白以及SIRT1和AMPK的表达水平。结果 1.MT减轻高糖对睾酮合成的不利影响:DM组大鼠睾丸组织和TM3细胞高糖组中,睾酮合成相关限速酶（St AR、3β-HSD和P450scc）的表达水平较对照组显著下调,MT处理组明显改善。2.MT对AMPK/SIRT1通路和线粒体功能的影响:DM组大鼠睾丸组织和高糖处理的TM3细胞中,SIRT1、AMPK、p-AMPK和线粒体合成及其功能相关蛋白（mt TFA、NRF1、ATPB和COXIV）的表达水平较对照组均下降,MT干预后上调,TM3细胞胞浆中SIRT1和PGC-1α表达与以上趋势相同。此外,通过电镜观察发现DM组大鼠睾丸组织中线粒体肿胀,MT处理组有明显改善。JC-1荧光探针检测TM3细胞MMP;Mito Tracker标记线粒体数量和形态;Mito SOX检测m ROS。以上结果显示,高糖处理时,TM3细胞中MMP下降,受损线粒体数量增加,m ROS产生增加;MT处理能显著改善MMP及降低m ROS产生水平。证明高糖背景下MT可能通过激活SIRT1/PGC-1α/NRF1通路促进线粒体生物合成,保护线粒体合成功能。3.MT对自噬、线粒体自噬的影响:通过检测大鼠睾丸组织和TM3细胞中自噬相关蛋白（Beclin-1、Atg7和LC3）的表达和MDC标记TM3细胞中自噬小体,发现DM大鼠和高糖处理的TM3细胞中自噬相关蛋白表达下调,自噬小体减少,自噬水平降低,MT处理后自噬水平显著恢复。表明MT处理可能通过激活AMPK/SIRT1通路和自噬相关基因表达来改善高血糖诱导的Leydig细胞功能损伤。检测BNIP3L以及线粒体标记蛋白COXIV和自噬标记蛋白LC3的免疫荧光共定位来评估TM3细胞中的线粒体自噬水平,结果表明在高糖条件下,线粒体自噬活性降低,MT可上调BNIP3L相关的线粒体自噬活性。4.敲低Sirt1明显影响MT抗高糖损伤效应:在TM3细胞中敲低Sirt1发现,敲低组中MT上调高糖环境下的睾酮合成限速酶表达水平、激活自噬及线粒体自噬活性、保护线粒体合成和形态恢复的作用均受到抑制。表明MT对线粒体合成和功能的保护作用与SIRT1有关。5.MT对SIRT1的上调作用与ROS水平有关:高糖处理TM3细胞后,ROS水平明显上升,抗氧化酶GPX4下调,MT处理具有抗氧化应激作用。为了进一步研究高糖背景下MT激活SIRT1的作用机制,在MT处理组中加入NAC中和ROS,结果显示SIRT1、AMPK、LC3和mt TFA表达水平明显低于未用NAC的MT处理组,表明中和ROS可阻断MT对TM3细胞中AMPK/SIRT1通路的刺激和对自噬和线粒体生物合成的促进作用。结论1.糖尿病性高血糖导致睾酮合成功能下降,并伴有自噬缺陷、线粒体功能障碍和氧化应激,MT干预能改善糖尿病并发的性腺功能损伤。2.MT处理通过激活SIRT1通路促进线粒体生物合成和调节自噬/线粒体自噬水平,改善高糖导致的线粒体功能障碍,保护睾酮合成功能。3.高糖背景下MT激活SIRT1通路与ROS水平和氧化应激相关。