【摘 要】
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目的建立人远隔缺血预适模型、人内皮细胞HMEC-1缺血预适应模型和SH-SY5Y细胞氧糖剥夺模型（Oxygen Glucose Deprivation,OGD）。分离外泌体,通过分析细胞和外泌体内基因表达差异,探讨RIPC中起到神经保护的主要物质,明确保护物质的来源和作用方式。方法（1）对招募的男性大学生志愿者使用远隔缺血预适应训练仪进行缺血预适应并采集肘中静脉血后分离血清,使用差速超速离心法分离
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目的建立人远隔缺血预适模型、人内皮细胞HMEC-1缺血预适应模型和SH-SY5Y细胞氧糖剥夺模型（Oxygen Glucose Deprivation,OGD）。分离外泌体,通过分析细胞和外泌体内基因表达差异,探讨RIPC中起到神经保护的主要物质,明确保护物质的来源和作用方式。方法（1）对招募的男性大学生志愿者使用远隔缺血预适应训练仪进行缺血预适应并采集肘中静脉血后分离血清,使用差速超速离心法分离血清外泌体,使用透射电镜和芯片测序等方法对外泌体形态、大小和内容物进行检测和鉴定。（2）将外泌体与SH-SY5Y细胞孵育后进行OGD处理,通过Westren Blot、Real-Time PCR、MTS、COBRA和生物信息学预测等技术检测RIPC外泌体对神经细胞缺血耐受和基因组甲基化的影响,明确RIPC外泌体主要保护物质、相互作用关系和保护机制。（3）利用慢病毒在SH-SY5Y细胞中过表达miR-126,结合生物信息学预测结果明确miR-126与基因组甲基化的关系。（4）对HMEC-1进行缺血预适应训练,使用Real-Time PCR分析细胞和外泌体中miR-126表达水平,以明确RIPC外泌体来源。结果（1）透射电镜和Westren Blot结果显示超速离心法可以成功分离血清外泌体,且能保证外泌体的纯度和均一性。（2）外泌体与SH-SY5Y细胞共孵育4h后,通过激光共聚焦显微镜观察到外泌体进入到SH-SY5Y细胞。（3）外泌体与SH-SY5Y细胞共孵育24h后,细胞内基因组甲基化水平显著下降,DNMT m RNA均下调,而DNMT3A和DNMT3B蛋白表达降低。这一现象可能是RIPC外泌体中高表达miR-126与DNMT3B m RNA结合造成的。（4）利用慢病毒在SH-SY5Y细胞中过表达miR-126,SH-SY5Y细胞中DNMT1和DNMT3A表达上调,DNMT3B基因显著低表达,且细胞基因组甲基化程度下降。（5）与OGD组相比,SH-SY5Y细胞加入RIPC外泌体后,活力恢复明显,P53、Bax等促凋亡蛋白水平下调,Bcl-2等抗凋亡蛋白表达上调,SH-SY5Y基因组甲基化水平降低。（6）在正常培养或OGD处理时加入富含miR-126的外泌体,SH-SY5Y细胞内VEGF基因表达显著上调,而在细胞内过表达miR-126时,细胞内VEGF的表达明显被抑制。（7）低氧/缺血预适应处理HMEC-1细胞后,细胞内和培养基外泌体中miR-126表达上调了近两倍。结论RIPC可以刺激肢体的微血管内皮细胞分泌富含miR-126的外泌体,这些外泌体随着血液进入神经中枢后,可能通过抑制神经细胞DNMT3B的表达并影响神经细胞DNA甲基化,进而促进低氧/缺血耐受相关基因表达,发挥神经保护作用。
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