研究背景和目的肝细胞肝癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）是我国最常见的恶性肿瘤之一，并且死亡率非常高，其原因一方面因为肝癌的生物学行为，另一方面因为缺乏早期诊断，而已有的AFP在肝癌诊断上只有60％左右的阳性率。如果能找到相对肝癌特异的蛋白或基因，将会对研究肝癌的发病机制以及提高早期诊断有重要的意义。目前研究发现人类癌抗原(Human Carcinoma Antigen，HCA)作为一种糖蛋白复合物在癌症中广泛表达，其蛋白成分具有肿瘤相对特异性。寻找特异性的肝癌相关的HCA分子为提高原发性肝癌的早期检出率以及了解HCC的生物学行为和靶向治疗提供了新线索和新依据。应用免疫沉淀联合质谱技术鉴定出细胞骨架相关膜蛋白4(cytoskeleton-associatedmembrane protein CKAP4）是HCA的一个组成成分。CKAP4，又称P63，细胞骨架相关膜蛋白4（CKAP4），分子量63KD，是一种II型跨膜蛋白，连接于内质网与微管之间。其由氨基端106个氨基酸的细胞溶质尾，跨膜区以及羧基端474个氨基酸的细胞浆区组成。早期研究表明CKAP4对维持内质网结构具有重要的作用。最近被鉴定为组织纤维蛋白溶酶原激活剂（t-PA），表面活性蛋白A（SP-A），以及抗增生因子（anti-proliferative factor，APF）的细胞表面受体。其中已有研究表明CKAP4与APF结合可以抑制膀胱癌细胞的增殖，其作用机制可能和Wnt信号通路相关。而Wnt信号通路是众多组织中调控细胞增殖、凋亡和分化的重要通路。因而探讨CKAP4在肝癌发生发展中的作用具有重要的临床价值。目前有关CKAP4在肝癌细胞表达情况以及在肝癌发生发展中处于何种地位尚无文献报道。本研究的目的一方面研究CKAP4在肝癌中的表达情况并结合临床资料探讨其表达与肝癌发生发展的关系；另一方面研究CKAP4在肝癌中的生物学作用及机制；最后将研究CKAP4血清学检测诊断肝癌的应用价值。从而有助于了解肝癌的生物学行为及为可能的靶向治疗和诊断提供实验和理论依据。实验方法1.运用real-time PCR、western blot以及IHC等方法检测肝癌、癌旁及正常肝组织中CKAP4的表达情况；2. IHC方法检测大鼠DEN诱癌过程中CKAP4在肝脏中表达的动态变化过程；3.结合临床资料统计分析CKAP4与相关临床指标及预后之间的关系；4.构建CKAP4高低表达的质粒并建立稳定转染空载体、高表达CKAP4及稳定干扰CKAP4的肝癌细胞系：WRL68-VT、WRL68-OV；7721-VT、7721-OV、7721-KD，用real-time PCR和western blot鉴定高低表达效果；5.采用CCK-8检测CKAP4高低表达对多种细胞系增殖的影响；6.用western blot检测在TNFα和CHX或DTT刺激下CKAP4高低表达对细胞凋亡的影响；7. CKAP4高低表达稳转细胞系经EGF刺激后，通过real-time PCR和western blot检测Wnt信号通路和EMT相关的蛋白的变化；8.扩增CKAP4高低表达稳转细胞系行裸鼠皮下荷瘤，观察肿瘤生长情况。并用real-time PCR、western blot以及IHC等方法对肿瘤组织分析；9.通过ELISA检测大鼠DEN诱癌过程中血清中CKAP4的动态变化，及比较正常、肝炎、肝硬化及肝癌病人血清中CKAP4的表达；结果1. CKAP4在肝癌组织中高表达：①基因转录水平和蛋白表达水平显示CKAP4在肝癌组织中表达明显高于癌旁组织和正常组织；○2IHC结果根据着色强度和着色面积评分显示肝癌组织评分结果明显高于癌旁组织和正常组织的评分结果，并具有统计学意义；以正常组织的着色情况为基准分为高表达组（61%）和低表达组（39%）。2.在大鼠DEN诱癌过程中，CKAP4在肝脏中的表达逐渐升高：IHC显示实验组随着时间延长CKAP4表达越来越高，在10W时实验组明显高于对照组，而对照组CKAP4表达无明显变化。3.临床资料统计分析：①卡方检验显示CKAP4表达和肿瘤大小、肝内转移、门静脉侵犯、BCLC分期成负相关；○2CKAP4表达和生存时间和无瘤生存时间呈正相关并具有统计学意义。4. CKAP4高低表达对肝癌细胞的影响：①CKAP4过表达抑制细胞的增殖和促进细胞的凋亡，干扰掉促进细胞的增殖和抑制细胞的凋亡；○2CKAP4过表达后抑制细胞的迁移和克隆形成能力，和对照组相比具有统计学意义；5.相关机制研究：抑制Wnt信号转导通路和EMT的发生①在EGF刺激下，和对照组相比CKAP4过表达可抑制GSK3β、AKT、JNK、ERK的磷酸化能力；在蛋白水平和基因转录水平抑制β-catenin、c-Myc和cyclinD1的表达。○2在EGF刺激下，和对照组相比CKAP4过表达在蛋白水平和基因转录水平抑制snail、vimentin的表达，促进E-cadherine、ZO-1的表达。6.裸鼠荷瘤实验：①皮下肿瘤大小：干扰CKAP4后肿瘤较对照组大，过表达组肿瘤最小。○2肿瘤组织分析显示CKAP4过表达可抑制Wnt信号转导通路相关蛋白的表达及抑制EMT的发生，和体外实验结果一致。7. CKAP4在肝癌患者血清中的浓度较正常人高：①ELISA检测在大鼠DEN诱癌过程血清中CKAP4浓度变化，结果显示从8W开始CKAP4浓度明显高于正常，到14w时CKAP4浓度达到最高，并有统计学意义。○2ELISA结果显示肝炎、肝硬化、肝癌病人血清中CKAP4浓度明显高于正常人，其中肝炎、肝癌与正常相比具有统计学意义；结论本研究发现CKAP4在肝癌组织中高表达，与肿瘤大小、肝内转移、门脉侵犯及BCLC分期密切相关。单因素分析CKAP4是OS和DFS的独立风险因素，多因素分析CKAP4是OS的风险因素，有望作为评估肝癌预后的一项有前景的指标。进一步体内和体外实验研究表明CKAP4在肝癌发生过程中起抑制作用，其可能通过抑制Wnt信号通路和EMT的发生发挥其生物学作用。另外，CKAP4在肝癌血清中浓度高于正常，ROC曲线分析CKAP4作为肝癌的诊断指标和AFP比较效能偏低，但是在AFP<10ng/ml时，CKAP4作为肝癌诊断指标较AFP效能较高。因此CKAP4与AFP协同应用有望提高肝癌的检出率。