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鉴于先天免疫系统既是机体抵御病原体感染的第一道屏障,也是适应性免疫的基础,因此激活先天免疫已成为一种探索癌症治疗的新途径。研究发现线粒体DNA（Mitochondrial DNA,mt DNA）含有与细菌DNA相似的低甲基化Cp G序列,可激活c GAS-STING-IRF3通路介导的先天免疫反应。此外,基于线粒体对活性氧高度敏感,使得靶向线粒体的光动力疗法成为诱导mt DNA损伤和释放的理想手段。5-氨基乙酰丙酸（5-Aminolevulinic acid,ALA,FDA批准用于光动力疗法）,可促进光敏剂原卟啉Ⅸ（Protoporphyrin IX,PpIX）在线粒体中合成,成为诱导mt DNA释放的理想底物。然而,ALA转化效率低,PpIX代谢为无光敏活性的血红素（Heme）,导致细胞内PpIX积累不足限制了其疗效。受ALA（ALA-PpIX-Heme）天然生物转化过程的启发,我们开发了一种具有调节光敏剂代谢功能的装载脱氧核酶（Deoxyribozyme,DNAzyme）的纳米颗粒（ALA＆Dz@ZIF-PEG）,用于光动力增效肿瘤免疫治疗。首先将ALA和可剪切信使核糖核酸（Messenger RNA,m RNA）的DNAzyme包裹到沸石咪唑酯骨架-8（Zeolitic imidazolate framework-8,ZIF-8）中,进而采用DSPE-PEG2000修饰,制备ALA＆Dz@ZIF-PEG纳米颗粒。该纳米颗粒一旦进入癌细胞,可在溶酶体的酸性环境下分解并释放锌离子、ALA和DNAzyme。值得注意的是,释放的锌离子可以通过抑制线粒体复合物IV的活性来阻断线粒体有氧呼吸,通过缓解肿瘤缺氧来增强氧气依赖性粪卟啉原III氧化酶的活性,从而促进ALA向PpIX的转化,作为PpIX产生的“开源策略”。同时锌离子还作为DNAzyme的辅助因子,激活DNAzyme沉默亚铁螯合酶（催化PpIX转化为无光活性的Heme）的m RNA,作为降低PpIX失活的“节流策略”,协同促进线粒体中PpIX的积累和激光照射下的mt DNA释放。此外,锌离子提高了c GAS的催化酶活性,进一步放大了mt DNA/c GAS-STING通路介导的先天免疫效应。具体研究内容如下:1.ALA＆Dz@ZIF-PEG的制备和表征首先制备ALA＆Dz@ZIF-PEG纳米颗粒,然后,通过透射电子显微镜和动态光散射对ALA＆Dz@ZIF-PEG纳米颗粒的形貌、粒径和电位进行表征,结果显示ALA＆Dz@ZIF-PEG纳米颗粒呈类球形结构,平均直径约为60 nm,Zeta电位为-14.1 m V。接下来考察了在p H 5.0条件下ALA＆Dz@ZIF-PEG的体外释放特性,该纳米制剂在12 h内的ALA累计释放率达到88.20%,DNAzyme累计释放率达到90.16%。此外凝胶电泳实验表明,随着锌离子浓度的增加,DNAzyme剪切底物的效率显著提高,证明DNAzyme剪切m RNA的效率具有锌离子依赖性。同时,我们证明ALA＆Dz@ZIF-PEG在p H 5.0条件下释放的锌离子,足够启动DNAzyme的剪切活性。最后,稳定性实验结果表明,ALA＆Dz@ZIF-PEG具有显著的物理稳定性,为其体内应用奠定了基础。2.ALA＆Dz@ZIF-PEG的体外抗肿瘤活性研究以人源乳腺癌细胞MCF-7为模型细胞,考察ALA＆Dz@ZIF-PEG的体外抗肿瘤活性。首先,考察纳米制剂调控光敏剂PpIX胞内代谢的能力。MCF-7细胞内锌离子检测结果表明,ALA＆Dz@ZIF-PEG能显著升高胞内的锌离子水平。一方面通过检测肿瘤细胞乏氧情况,验证了锌离子可通过抑制线粒体复合物Ⅳ活性改善乏氧,提高氧依赖性粪卟啉原III氧化酶活性。另一方面胞内蛋白质印迹实验结果表明,Dz@ZIF-PEG组可有效地降低胞内的亚铁螯合酶表达量。最终结果显示,纳米颗粒共装载ALA和DNAzyme后,胞内的PpIX含量最高。接着,考察纳米制剂诱导线粒体损伤和激活先天性免疫的特性。胞内活性氧、线粒体膜电位、细胞活/死染色及细胞凋亡实验结果表明,相比于其他给药组,ALA＆Dz@ZIF-PEG组显著提高MCF-7细胞内活性氧水平,降低线粒体膜电位,其凋亡率达到60%以上。同时,发现ALA＆Dz@ZIF-PEG处理后的胞浆mt DNA增多,环鸟甘酸-腺苷酸、磷酸化干扰素调节因子3、干扰素-β相继增加,这些数据证明胞浆mt DNA作为先天免疫的激活剂,能够有效地激活c GAS-STING通路并诱导干扰素-β产生。3.ALA＆Dz@ZIF-PEG在裸鼠体内药效学研究以人源乳腺癌细胞MCF-7构建荷瘤裸鼠模型,考察ALA＆Dz@ZIF-PEG在裸鼠体内的抗肿瘤活性。体内分布实验表明,近红外荧光染料（Near-infrared fluorescence dye,IR783）标记的Dz@ZIF-PEG在肿瘤部位有更强的荧光信号,在给药6 h时荧光强度达到最大,且在肿瘤部位的滞留时间较长。其次,给药期间荷瘤裸鼠的相对瘤体积变化结果显示,ALA＆Dz@ZIF-PEG组相对肿瘤体积最小,治疗结束后其抑瘤率高达80%。肿瘤组织锌离子、PpIX及活性氧含量检测结果表明,ALA＆Dz@ZIF-PEG可明显增加肿瘤组织内的锌离子水平、增强线粒体内PpIX蓄积及光照下高效诱导活性氧产生。苏木精-伊红染色和原位末端转移酶标记实验结果显示,ALA＆Dz@ZIF-PEG组肿瘤组织发生明显凋亡和坏死,而各组荷瘤裸鼠的主要器官没有发生明显的变化,并且血液生化和血液学分析没有明显变化,说明该纳米系统无明显的毒副作用。4.ALA＆Dz@ZIF-PEG的体内光免疫治疗效果研究以鼠源乳腺癌细胞4T1构建荷瘤小鼠模型,进一步考察了ALA＆Dz@ZIF-PEG的光免疫治疗效果。在体内抗肿瘤活性实验中,ALA＆Dz@ZIF-PEG组荷瘤小鼠的肿瘤体积最小,重量最轻,表现出显著的肿瘤抑制作用。此外,肿瘤组织的苏木精-伊红染色显示ALA＆Dz@ZIF-PEG组核皱缩现象最严重;肿瘤组织的原位末端转移酶标记技术染色结果显示,ALA＆Dz@ZIF-PEG处理后,肿瘤细胞凋亡现象最明显,再次证实了ALA＆Dz@ZIF-PEG具有优异的体内抗肿瘤效果。接着检测免疫激活效应,蛋白质印迹实验观察到ALA＆Dz@ZIF-PEG组TANK-结合激酶1和干扰素调节因子3的磷酸化水平最高。此外,ALA＆Dz@ZIF-PEG治疗组小鼠血清干扰素-β水平高于其他组,提示ALA＆Dz@ZIF-PEG能有效激活c GAS-STING通路,产生干扰素-β。采用流式细胞术分别检测肿瘤浸润性自然杀伤细胞、树突状细胞和细胞毒性T淋巴细胞。与其他治疗方法相比,ALA＆Dz@ZIF-PEG治疗可将更多的自然杀伤细胞募集到肿瘤组织中,表明ALA＆Dz@ZIF-PEG治疗可有效激活先天免疫。此外,ALA＆Dz@ZIF-PEG处理的小鼠肿瘤浸润树突状细胞的比例最高,表明ALA＆Dz@ZIF-PEG能有效促进树突状细胞的成熟。ALA＆Dz@ZIF-PEG组肿瘤浸润性细胞毒性T淋巴细胞的数量最高,表明抗原特异性T细胞反应增强。同时,ALA＆Dz@ZIF-PEG治疗组血清中白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α水平最高。此外,我们也初步考察了制剂的生物安全性。各制剂处理组小鼠体重均呈上升趋势,心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏的苏木精-伊红染色结果均显示细胞排列紧密边缘清晰,表明制备的纳米颗粒生物安全性较好。综上所述,本文成功制备ALA＆Dz@ZIF-PEG纳米制剂,通过“开源节流”策略促进了PpIX的线粒体蓄积,进而诱导mtDNA释放,激活先天免疫。该研究有望扩大ALA的临床效益,在光免疫治疗中具有重要的应用前景。