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本试验建立氟暴露HepG2细胞模型,分析不同剂量的氟离子(Fluorine ion,F-)对HepG2细胞的活性、生长形态、超微结构、细胞周期及细胞内氧化应激的影响,从凋亡和铁死亡两个角度研究F-诱导细胞死亡的方式,为阐明氟致HepG2细胞损伤的分子机制提供理论依据,结果如下:1.氟对细胞生长和增殖影响的研究1.1氟对HepG2细胞活力和增殖的影响CCK-8法检测表明,HepG2细胞的存活率随F-暴露剂量(1、2.5、5、10、20和50 mmol/L)增加而逐渐降低,F-对HepG2细胞48 h的IC50为3.76mmol/L。根据F-对HepG2细胞的IC50测定结果,选择0、1.25、1.88、2.51、3.76、5.01、6.27和7.52 mmol/L F-暴露浓度分别处理HepG2细胞0、24、48、72和96 h,通过CCK-8法检测,结果表明HepG2细胞的活力发生不同程度的降低,且随时间增加细胞活力降低更加显著,呈现剂量-时间依赖效应。1.2氟对HepG2细胞形态和超微结构的影响观察细胞形态,0 mmol/L F-组细胞大小正常,生长良好,细胞边缘清晰,聚集成片生长,1.88、2.51和3.76 mmol/L F-组细胞随浓度增加,细胞生长状态差,形状有向两边拉长的趋势,细胞密度降低,数目减少,边缘模糊;观察细胞超微结构,0 mmol/L F-组细胞表面微绒毛完整,可见清晰的双层核膜,内质网、线粒体形态结构正常,3.76 mmol/L F-组细胞微绒毛断裂甚至消失,细胞内大量溶酶体和脂肪滴,线粒体缩小、嵴断裂,内质网扩张。1.3氟对HepG2细胞DNA的影响免疫荧光检测发现,与0 mmol/L F-组相比,1.88、2.51和3.76 mmol/L F-组PCNA蛋白表达表达降低(P<0.01),F-抑制了HepG2细胞DNA的合成;与0mmol/L F-组相比,2.51和3.76 mmol/L F-组HepG2细胞的γ-H2AX表达上升了(P<0.01),表明F-引起了HepG2细胞DNA双链的断裂。1.4氟对HepG2细胞周期的调控流式细胞术分析表明,与0 mmol/L F-组相比,1.88、2.51和3.76 mmol/L F-组HepG2细胞G0/G1期细胞比例分别降低(P<0.01);同时S期细胞的比例增加了(P<0.05或P<0.01),G2/M期细胞比例无明显变化,细胞在S期阻滞。1.5氟对HepG2细胞周期蛋白的影响采用免疫荧光分析、Western Blot和实时荧光定量PCR法检测细胞内ATM、CHK2、CDC25A、CDK2和Cyclin A2/D1/E1的蛋白和m RNA表达,结果发现,与0 mmol/L F-组相比,在F-组中,cyclin D1的m RNA和蛋白水平升高(P<0.01),而ATM、CHK2、CDC25A、cyclin A2、cyclin E1和CDK2的m RNA和蛋白水平降低(P<0.05或P<0.01)。1.6氟对HepG2细胞的氧化损伤通过流式细胞术检测分析,与0 mmol/L F-组相比,1.88、2.51和3.76mmol/L F-组中,细胞内ROS水平上升(P<0.05或P<0.01);酶标仪检测结果显示,与0 mmol/L F-组相比,在1.88,2.51和3.76 mmol/L F-组,T-SOD活性降低(P<0.05或P<0.01),MDA含量相应增加(P<0.05或P<0.01);通过JC-1荧光探针检测发现,与0 mmol/L F-组相比,随着F-剂量的增加,MMP逐渐降低,绿色荧光/红色荧光强度增加(P<0.01)。1.7氟对HepG2细胞凋亡的影响通过流式细胞术检测细胞凋亡,与对照组相比,1.88、2.51和3.76 mmol/L F-组未见明显的凋亡阳性细胞增加(P>0.05)。2.氟对HepG2细胞铁死亡的影响2.1氟对HepG2细胞形态观察和活力的影响观察细胞形态,0 mmol/L F-组HepG2细胞生长良好,细胞边缘清晰;与0mmol/L F-组相比,2.51 mmol/L F-组细胞密度降低,细胞大小不一,形态不规则,有向两端拉长趋势,细胞边缘模糊不清;与2.51 mmol/L F-组相比,10μmol/L Fer-1+2.51 mmol/L F-组细胞密度降低,细胞两端拉长趋势较2.51mmol/L F-组弱,部分细胞边缘模糊,整体状态好于2.51 mmol/L F-组。2.2氟对HepG2细胞活力的影响CCK-8测定结果表明,与0 mmol/L F-组相比,2.51 mmol/L F-组细胞活力降低(P<0.01),与2.51 mmol/L F-组相比,10μmol/L Fer-1+2.51 mmol/L F-组细胞活力升高(P<0.01),试验证实加入Fer-1能够提升细胞活力。试验过程中,溶剂DMSO对细胞活力无明显影响。2.3氟对细胞氧化应激的影响检测细胞氧化标志物发现,与0 mmol/L F-组相比,2.51 mmol/L F-组T-SOD和GSH-PX活性分别降低(P<0.01),GSH和GPX4含量分别降低(P<0.01),同时MDA和LDH含量分别升高(P<0.01);与2.51 mmol/L F-组相比,2.51 mmol/L F-+10μmol/L Fer-1组的T-SOD和GSH-PX活性分别提高了(P<0.01),GSH和GPX4含量分别提高(P>0.05),MDA和LDH含量分别降低(P<0.01)。荧光检测结果发现,与0 mmol/L F-组相比,2.51 mmol/L F-组ROS上升(P<0.01),MMP下降,绿色荧光/比红色荧光强度增加(P<0.01);与2.51 mmol/L F-组相比,2.51 mmol/L F-+10μmol/L Fer-1组的ROS水平降低(P<0.01),MMP升高,绿色荧光/比红色荧光降低(P<0.01)。2.4氟对HepG2细胞内铁含量的影响检测细胞内铁含量结果表明,与0 mmol/L F-组相比,2.51 mmol/L F-组细胞铁含量提高(P<0.01),与2.51 mmol/L F-组相比,10μmol/L Fer-1+2.51mmol/L F-组的铁含量降低(P<0.01)。2.5氟对HepG2细胞内铁死亡相关基因表达的影响与0 mmol/L F-组相比,2.51 mmol/L F-组SLC40A1的m RNA表达下降(P<0.05),10μmol/L Fer-1组的m RNA表达上升(P<0.05);与0 mmol/L F-组相比,2.51 mmol/L F-组TFRC的m RNA表达上升(P<0.01),2.51 mmol/L F-+10μmol/L Fer-1组的m RNA表达上升(P<0.01)。与0 mmol/L F-组相比,2.51mmol/L F-组CD98的m RNA表达下降(P<0.01),10μmol/L Fer-1组的m RNA表达上升(P<0.05);x CT的m RNA各组表达无明显变化(P>0.05)。与0 mmol/L F-组相比,10μmol/L Fer-1组的SLC40A1蛋白表达上升(P<0.01);与0 mmol/L F-组相比,2.51 mmol/L F-组TFRC的蛋白表达上升(P<0.01),2.51 mmol/L F-+10μmol/L Fer-1组的蛋白表达上升(P<0.01);与0mmol/L F-组相比,2.51 mmol/L F-组CD98的蛋白表达下降(P<0.01),10μmol/L Fer-1组的蛋白表达下降(P<0.01),2.51 mmol/L F-+10μmol/L Fer-1组的蛋白表达下降(P<0.01);x CT的蛋白各组表达表达无明显变化(P>0.05)。综上所述,过量的F-通过干扰ATM/CHK2信号通路、抑制线粒体功能、诱导DSBs,造成细胞周期的停滞,影响了HepG2细胞的增殖活性,通过抑制GSH水平进而影响GSH-PX、GPX4活性和ROS水平引起细胞的氧化应激,打破铁代谢平衡,造成了HepG2细胞的铁死亡。