益生解淀粉芽孢杆菌的筛选及其抑菌产物特性的研究

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解淀粉芽孢杆菌产生的次级抑菌代谢产物具有一定的广谱抑菌作用,因此解淀粉芽孢杆菌不仅能够作为益生菌应用在饲料行业,而且能够作为生防菌应用在果蔬保鲜行业。本研究通过筛选对常见致病菌具有抑菌效果的益生菌,先经复筛确认是菌株产生的抑菌次级代谢产物,再研究抑菌物质的相关理化性质与生物学特性,最后优化产抑菌物质的发酵条件与培养基营养成分,对未来应用于饲料发酵和果蔬保鲜具有重要意义。从广西传统发酵食品酸笋、酸辣椒、酸水,特色水果沃柑,养殖动物肠道等样品中初步筛选出对大肠杆菌具有抑制效果的12株乳酸菌与9株芽孢杆菌。经过排除有机酸影响后乳酸菌的抑菌效果消失,排除过氧化氢影响后剩余5株抑菌效果较强的芽孢杆菌。选择一株抑菌效果最强的菌株进行形态学观察、革兰氏染色、16S r DNA分子鉴定并命名为解淀粉芽孢杆菌A13。对解淀粉芽孢杆菌A13产生的抑菌物质进行理化分析,表明该菌株产生的抑菌物质经多种蛋白酶处理后能保持稳定的抑菌活性,且在强酸强碱、高温以及多种金属离子处理后,仍能保持良好的抑菌活性。该菌株产生的发酵上清液不仅对常见致病细菌如大肠杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌以及肠炎沙门氏菌等具有显著的抑制效果,而且对罗汉果白绢病菌、沃柑皮壳青霉以及香蕉枯萎病尖孢镰刀菌等致病真菌也有显著的抑制效果。此外,在皮壳青霉侵染沃柑实验中,发酵上清液能够有效抑制皮壳青霉侵染沃柑,使沃柑腐烂程度显著降低,表现出良好的生物防治效果。对解淀粉芽孢杆菌A13产生的抑菌物质进行分离纯化,通过比较及优化硫酸铵盐析法、酸沉淀法、甲醇抽提法、乙酸乙酯萃取法粗提发酵上清液中抑菌物质,确定80%饱和度硫酸铵盐析法为适宜方法。再将粗提所得抑菌产物进行凝胶过滤层析分离纯化,能够洗脱出较多抑菌物质。经过Tris-Tricine-SDS-PAGE电泳以及HPLC分析后表明洗脱液中还存在七种蛋白类物质。经过单因素与响应面结合优化解淀粉芽孢杆菌A13产抑菌物质的培养条件与培养基营养成分。优化的发酵条件为:种龄4 h、培养温度37℃、培养时间12 h;培养基营养成分为:大豆蛋白胨10.5 g/L、麦芽糖9.5 g/L、氯化钠2 g/L;优化后发酵液对大肠杆菌产生的抑菌圈直径可达到26.4 mm,比未优化前增长了42.7%。
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