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研究背景和目的:乳腺癌复发转移及相关的并发症是乳腺癌患者死亡的主要原因,上皮-间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）是癌细胞获得侵袭性表型的关键过程。既往研究表明,侵袭性强的乳腺癌细胞比非侵袭性细胞含有更多的脂滴,脂滴代谢在肿瘤细胞侵袭发挥重要作用,但目前EMT信号通路的关键调节因子对脂滴脂肪酸代谢的调控机制及其对细胞侵袭能力的作用仍有待阐明。脂质代谢酶是调控脂滴形成的关键因素,本课题以脂质代谢酶作为切入点,在前期的预实验中发现EMT信号通路的关键调节因子锌指E-box结合同源异型盒2（zinc finger E-box-binding homeobox 2,ZEB2）和脂肪酸代谢的关键限速酶长链脂酰辅酶A合成酶4（long chain acyl Co A synthetase 4,ACSL4）,在高侵袭性乳腺癌中高表达且其表达量之间成正相关,我们推测:ZEB2和ACSL4可能与乳腺癌细胞内脂滴形成和侵袭转移密切相关,因此,本课题选取ZEB2和ACSL4对乳腺癌的转移机制进行研究,探讨ZEB2通过转录激活ACSL4调节脂质代谢促进乳腺癌侵袭转移的作用及分子机制,旨在阐明EMT转录因子调节脂肪酸代谢促进乳腺癌转移的调控机制,为寻找疾病进展的诊断标志物和肿瘤复发转移治疗靶点提供了新思路。研究方法:（1）通过RNA-seq测序筛选MCF-7野生型与耐药细胞系中差异表达的m RNAs;利用TCGA数据库分析ACSL4和ZEB2的相关性;Western blot和免疫组化技术分别检测不同侵袭性乳腺癌细胞系和乳腺癌临床标本中ZEB2和ACSL4的表达水平,Kaplan-Meier数据库分析其与乳腺癌预后的关系。（2）Transwell实验和划痕实验检测细胞的侵袭转移能力;利用免疫荧光染色测量乳腺癌细胞的基础脂滴含量及转移过程脂滴的变化,外源添加油酸,观察其对细胞脂滴形成和侵袭能力的影响。（3）对干扰ACSL4的差异基因进行Reactome通路富集分析;检测干扰ACSL4、ZEB2后细胞内ATP含量、糖酵解水平和长链脂肪酸氧化应激情况。（4）用荧光素酶报告基因检测系统和染色质免疫共沉淀技术分析ZEB2对ACSL4转录调控机制;（5）用泛素化实验、放线菌酮实验、免疫共沉淀技术分析ZEB2和ACSL4之间的可能相互作用。（6）构建慢病毒稳定干扰ACSL4的乳腺癌自发肺转移模型,体内验证ACSL4对乳腺癌转移和对细胞内脂滴形成的影响。研究结果:（1）ZEB2和ACSL4在高侵袭性乳腺癌中过表达野生型与耐药株的RNA-seq测序结果提示,ACSL4与ZEB2在耐药细胞中高表达,TCGA数据库分析发现ACSL4与ZEB2的基因表达在乳腺癌中呈正相关（r=0.76）,ACSL4与ERα成负相关（r=-0.33）;与低侵袭性乳腺癌细胞系T47D、MCF-7细胞相比,在高侵袭性乳腺癌细胞株MDA-MB-231、BT549和紫杉醇耐药细胞TAXOL-7细胞株里,ACSL4和ZEB2表达量都较高。免疫组化的结果显示,ZEB2和ACSL4蛋白在ERα低表达乳腺癌中含量丰富,而在ERα高表达乳腺癌中含量较低。Kaplan-Meier数据库分析提示,ACSL4或ZEB2高表达患者的进展后生存率（post-progression survival,PPS）都较低。（2）ACSL4过表达参与ZEB2介导的乳腺癌侵袭转移用小分子RNA干扰MDA-MB-231细胞ACSL4和ZEB2基因的表达,ACSL4和ZEB2的敲低,显著降低了细胞的侵袭转移能力;干扰ACSL4的RNA-seq结果,差异基因KEGG通路富集在紧密连接（tight junction）、黏着斑（focal adhesion）通路,干扰ACSL4和ZEB2的表达,上皮标志物（E-cadherin）表达升高,间充质标志物（N-cadherin和Vimentin）表达下降;ACSL4参与ZEB2介导乳腺乳腺癌转移,过表达ACSL4能够部分逆转ZEB2干扰引起抑制效应。（3）ACSL4促进脂滴的形成和脂肪酸β氧化测量MCF-7、TAXOL-7、MDA-MB-231乳腺癌细胞基础脂滴含量,耐药细胞TAXOL-7和MDA-MB-231在细胞内储存更多的脂滴;干扰ACSL4和ZEB2都可以显著降低细胞内脂滴的含量;脂质组学结果显示,干扰ACSL4可引起乳腺癌细胞的脂质组成改变;外源性添加油酸,可以提高乳腺癌细胞内脂滴的含量,促进乳腺癌细胞的侵袭转移;Transwell实验提示,乳腺癌在转移的过程中细胞内的脂滴含量减少。干扰ACSL4的RNA-seq数据的Reactome通路富集到脂肪酸代谢通路,脂肪酸β氧化的关键调节酶CPT1A表达降低;干扰ACSL4、ZEB2后,细胞内以长链脂肪酸为底物的耗氧量发生明显的降低,细胞的ATP含量也降低,而乳腺癌细胞的糖酵解过程变化不明显。（4）ZEB2转录激活ACSL4小分子RNA干扰ZEB2的表达,可明显降低ACSL4的m RNA表达水平和蛋白表达水平。荧光素酶报告基因实验表明ZEB2的高表达可以提高ACSL4启动子区的活性,以“CAGGT”序列结合-332bp至-100bp的位置;染色质免疫共沉淀实验显示ZEB2可以直接结合在ACSL4转录起始点-332bp左右的位置。（5）ACSL4调控ZEB2蛋白泛素化小分子RNA干扰ACSL4,可明显降低ZEB2的m RNA表达水平和蛋白表达水平;放线菌酮实验表明,ACSL4可以调节ZEB2蛋白表达;泛素化实验提示,ACSL4可能通过抑制ZEB2的泛素化降解来维持ZEB2蛋白的稳定;免疫共沉淀技术表明ACSL4和ZEB2共存在一个蛋白混合物中。（6）ACSL4在动物模型中促进乳腺癌细胞的转移稳定干扰ACSL4的小鼠肺部的荧光信号显著降低,HE染色肺部转移灶的数量明显减少,且经免疫组化染色的ACSL4、ZEB2和Vimentin表达量降低;稳定干扰ACSL4抑制原位乳腺癌细胞增殖;原位肿瘤进行冰冻切片免疫荧光染色,在小鼠体内干扰ACSL4的表达,乳腺癌细胞内的脂滴的含量降低。结论:脂滴含量高的乳腺癌细胞侵袭转移能力更强,ZEB2和ACSL4都通过促进脂滴形成和脂肪酸β氧化的作用,最终促进乳腺癌细胞的侵袭性转移;ZEB2直接转录激活ACSL4,并且ACSL4调控ZEB2蛋白泛素化水平影响蛋白稳定性。本研究初步阐明了EMT转录因子调节脂肪酸代谢促进乳腺癌转移的调控机制,为寻找疾病进展的诊断标志物和肿瘤复发转移治疗靶点提供了新思路。