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目的： 确定microRNA在胸腺增龄性萎缩过程中的作用，预测并鉴定胸腺增龄性萎缩过程中microRNA调节的靶基因，最终阐明胸腺增龄性萎缩过程中microRNA的分子调节机制。为进一步认识胸腺与老化，提高老龄人口健康水平提供科学的理论依据。 方法： 一、小鼠自然老化模型 C57BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司。分为四组:青龄组(1～2月)、中青龄组（6～7月）、中老龄组（10～11月），老龄组（19～20月）。每组8只，雌雄各半，健康无疾病，均为自然老化小鼠。饲养于中国医科大学附属盛京医院实验中心动物部。 二、胸腺细胞与胸腺上皮细胞的分离 1、乙醚麻醉法将小鼠麻醉，眼科弯摄夹起腹部中间表皮，然后向两边将腹膜剪开，再沿两侧剪开胸膜。沿胸腔两侧向上剪断肋骨，用眼科直摄将胸腔向上打开。最后用眼科弯摄小心取出胸腺组织，迅速放入无菌PBS液中。取材完毕。 2、将胸腺组织在无菌PBS中漂洗两遍，轻轻撕裂组织囊膜，释放出T细胞。再将组织放入DMEM溶液（DNaseⅠ，5U/ml;胶原酶Ⅳ，1mg/ml）中消化，37℃，15分钟，振荡2-3次去除残余T细胞。此步骤可以重复1-2次直到所有组织被溶解。 3、胸腺上皮细胞的富集:将消化下来的细胞进行CD45抗体（大鼠抗小鼠）染色，再经过含有偶联抗大鼠IgG(Miltenyi)磁珠的LS柱吸附、洗脱。CD45抗体为淋巴细胞特异性表达，因此洗脱得到的都是胸腺基质细胞，其中95％以上为上皮细胞。最后将收集到的TEC细胞于天平上称重。 三、筛选并鉴定青龄组与老龄组之间miRNA的表达差异 1、提取出TEC细胞后干冰保存并送交上海康成生物有限公司，小鼠miRNA表达谱芯片初步筛选青龄组与老龄组之间存在差异表达的miRNA。选出其中表达差异明显的miRNA，进行下一步的实时荧光定量PCR验证。 2、根据Ambion公司miRNA提取试剂盒说明书，从四年龄组小鼠TEC细胞中提取出miRNA，按NEB公司的Poly(A)聚合酶反应剂量，对miRNA进行Poly(A)加尾。进行反转录，其方法与总RNA反转录方法相同，仅反转录引物不同而已。 3、进行实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitate realtime-PCR)，观察不同年龄组之间miRNA表达的动态变化趋势。 4、为了提高miRNA靶基因预测的精确性，对miRNA进行进一步的鉴定。方法如下: (1)芯片筛选结果与Realtime-PCR结果一致。 (2)随年龄增长miRNA的表达趋势与TEC细胞重量变化趋势一致。 四、miRNA靶基因预测 从四个miRNA靶基因数据库（TargetScan、PicTar、Miranda和EIMMo）中查找均认可的靶基因，并且在各自的数据库排名都在200以内，以降低靶基因预测的假阳性率。 五、检测miRNA与其靶基因的相互作用 1、提取四年龄组小鼠胸腺上皮细胞的总RNA、反转录并进行Realtime-PCR反应，以检测小鼠体内靶基因与miRNA是否呈负相关。 2、构建分泌型荧光素酶(Gluc/SEAP)报告基因载体、单克隆筛选、扩增、纯化并用DNA测序方法检测插入片段是否包含靶基因3UTR区域。 3、将质粒与miRNA mimics用Lipofectamine2000共转染到HEK293细胞中，共分四组: (1)共转染空质粒与对照miRNA mimics; (2)共转染空质粒与实验miRNA mimics; (3)共转染靶基因3UTR区域质粒与对照miRNA mimics; (4)共转染靶基因3UTR区域质粒与实验miRNA mimics。 4、4小时后吸出转染液，用PBS清洗两遍。加入完全培养液培养48小时后，取细胞培养液检测荧光值的变化。 六、过表达或沉默miRNA对细胞增殖的影响 1、选用胸腺髓质上皮细胞(MTEC)进行体外细胞功能实验。CFDA SE方法检测细胞增殖。 2、用Lipofectamine2000与miRNA mimics按1∶1比例混合，室温孵育25分钟后，转染MTEC。分为三组: (1)对照组:仅Lipofectamine2000; (2)过表达组:转染miRNA; (3)沉默组:转染anti-miRNA。 3、48、72小时后分别检测细胞增殖能力变化。 七、过表达或沉默miRNA对细胞凋亡的影响 1、选用胸腺髓质上皮细胞(MTEC)进行体外细胞功能实验。Annexin V方法检测细胞凋亡。 2、用Lipofectamine2000与miRNA mimics按1∶1比例混合，室温孵育25分钟后，转染MTEC。分为三组: (1)对照组:仅Lipofectamine2000; (2)过表达组:转染miRNA; (3)沉默组:转染anti-miRNA。 3、48、72小时后分别检测细胞凋亡能力变化。 结果： 一、不同年龄组miRNA的表达差异 1、从小鼠miRNA表达谱芯片中，初步筛选出青龄组与老龄组之间存在差异表达的miRNA共53种。 2、从所有差异表达的miRNA选出其中表达差异明显的20种，进行实时荧光定量PCR反应，其中15种与芯片结果一致，另外5种表达结果与芯片不同。由于芯片样本量较少，且精确度较低，实时荧光定量PCR结果更可信。 3、在20种miRNA中，与小鼠TEC重量变化趋势一致的有13种。这13种miRNA可能与胸腺增龄性萎缩密切相关。 二、对miRNA进行靶基因预测并在体内初步验证 1、从四个哺乳动物miRNA靶基因预测数据库查找13种miRNA的靶基因。12种均找到相应靶基因。鉴于靶基因筛选条件，miR-382-3p未查到四个数据库共同认可的靶基因。 2、由于miR-146a参与多种炎症反应，并调节免疫细胞及抑制癌症等，且经过了芯片筛选与实时荧光定量PCR验证。因此，首先选定miR-146a作为下一步工作的目标。 3、通过上述方法得到miR-146a的靶基因是Irak1后，提取四年龄组小鼠TEC的总RNA、反转录并进行实时荧光定量PCR反应，检测出小鼠体内二者呈现负相关趋势(R=-0.37)，但是无统计学意义(P＜0.05)。原因为样本量较小。 三、荧光素酶报告基因显示miR-146a与Irak13UTR区域结合 1、构建荧光素酶报告载体后，单克隆筛选、扩增后纯化，再经过DNA测序，确认目标片段已经构建到载体上。 2、共转染miR-146a mimics与Irak13UTR质粒48小时后，HEK293细胞的荧光值明显下降，具体数值如下: (1)共转染空质粒与对照miRNA mimics（3.06±0.19）; (2)共转染空质粒与实验miRNA mimics（2.83±0.31）; (3)共转染靶基因3UTR区域质粒与对照miRNA mimics（2.72±0.33）; (4)共转染靶基因3UTR区域质粒与实验miRNA mimics（1.19±0.52）。前三组之间无差异。第四组与前三组相比，其荧光值明显下降。且有显著差异，与前三组比较的P值均小于0.001。因此确定miR-146a与Irak13UTR区域结合。 四、过表达或沉默miR-146a对胸腺上皮细胞增殖的影响 1、48小时后，过表达组（9.33±0.34）与对照组（1.00±0.49）相比，细胞的增殖能力明显上升(P＜0.001);沉默组（-1.08±0.25）与对照组（1.00±0.49）相比，细胞的增殖能力明显下降(P＜0.01)。 2、72小时后，过表达组（68.67±7.64）与对照组（1.00±0.14）相比，细胞的增殖能力明显上升(P＜0.001);沉默组（0.11±0.41）与对照组（1.00±0.14）相比，细胞的增殖能力无差异(P＞0.05)。 3、在MTEC中过表达miR-146a48小时后促进细胞增殖;72小时后更加明显地促进细胞增殖。沉默miR-146a48小时后抑制细胞增殖;72小时后抑制细胞增殖的能力有所下降。 五、过表达或沉默miR-146a对胸腺上皮细胞凋亡的影响 1、48小时后，过表达组（0.84±0.02）与对照组（1.00±0.08）相比，细胞的凋亡率无差异(P＞0.05);沉默组（1.74±0.41）与对照组（1.00±0.08）相比，细胞的凋亡率上升(P＜0.05)。 2、72小时后，过表达组（0.44±0.09）与对照组（1.00±0.05）相比，细胞的凋亡率明显下降(P＜0.001);沉默组（1.74±0.31）与对照组（1.00±0.05）相比，细胞的凋亡率明显上升(P＜0.001)。 3、在MTEC中过表达miR-146a48小时后影响不明显;72小时后明显抑制细胞凋亡。沉默miR-146a48小时后促进凋亡，但差异不明显;72小时后凋亡率差异较大。 结论： 胸腺增龄性萎缩过程中，胸腺上皮细胞的增殖下降、凋亡上升，胸腺细胞与胸腺上皮细胞之间的相互作用减弱。miRNA是调节胸腺上皮细胞功能的重要因子，并影响着胸腺增龄性萎缩进程。已发现13种miRNA与胸腺增龄性萎缩过程密切相关。其中miR-146a与靶基因Irak1结合，促进胸腺上皮细胞细胞增殖、抑制细胞凋亡。在老龄小鼠体内，miR-146a表达下调，胸腺上皮细胞增殖下降、凋亡增加，胸腺细胞发育微环境改变。