癌症仍是全球范围内的主要死亡原因,GLOBOCAN 2020统计2020年新发病例约为2千万例,在女性群体中乳腺癌为最常见的癌症,也是导致女性癌症死亡主要原因:约68万例死亡,占肿瘤死亡比例的15.5%。目前尽管放射治疗、化学治疗甚至靶向和免疫疗法得到了发展,但手术仍然是实体肿瘤患者的重要的治疗手段。手术的实施离不开麻醉的参与。麻醉及麻醉药物在接受手术治疗或非手术镇静等特定条件下（如入住重症监护病房的肿瘤患者）的作用尚未引起足够重视。有研究发现丙泊酚,七氟醚等麻醉药物和患者的应激可直接对肿瘤细胞产生影响,同时围手术期免疫功能变化间接的影响患者生存期。回顾肿瘤学和麻醉学的研究发现,麻醉药物和肿瘤细胞生物学行为的体外研究是其中一个热点。丙泊酚不仅在乳腺癌手术中使用,而且在肿瘤患者重症监护病房、术后恢复病房广泛应用,与临床关系密切,是应用在肿瘤患者中麻醉药物的主要代表。近来许多研究表明,麻醉药物丙泊酚会影响癌症的预后。它可通过多种途径发挥作用,例如涉及miRNA、lnc RNA和组蛋白乙酰化、DNA甲基化的通路,而且还可能调节遗传信号通路,包括缺氧、NF-κB、MAPK、SLUG、Nrf2等通路。还可通过促进肿瘤细胞凋亡以及调节CD3+、CD4+细胞和CTL、TAMs等影响患者的免疫功能,间接影响肿瘤患者生存期。检索文献发现在如此多的信号通路中存在一个关键基因:核基质结合蛋白（special AT-rich sequence-binding protein 1,SATB1）。SATB1在核基质或支架相关区域的特定富含AT序列处与DNA结合,通过识别双链DNA的糖磷酸结构与DNA的基质附着区（MAR）结合并诱导局部染色质环重塑,以磷酸化和乙酰化的方式控制基因的表达。SATB1改变了涉及肿瘤发生的多个方面的1000余个基因的表达,称为“基因组织者”,SATB1改变了乳腺癌细胞的基因表达谱,诱导了促进肿瘤生长和转移的侵袭性表型。涉及肿瘤发生的许多方面的多种基因受SATB1的调节,SATB1靶向大量的基因共同诱导肿瘤生长和转移。同时SATB1在介导免疫耐受以及T细胞分化和T细胞介导的免疫应答中起重要作用。此项研究回顾性分析接受新辅助治疗患者的病历资料,治疗效果,分析治疗后免疫指标的变化和SATB1等基因表达水平,确认SATB1与肿瘤患者治疗效果相关,间接反映肿瘤患者的预后。查阅miRBase、DIANA tools、Target Scan等生信工具筛选出miR-409可能是SATB1上游基因。应用q RT-PCR方法检测乳腺癌组织及癌旁非肿瘤组织miR-409表达,同时对细胞株:MDA-MB-453、MDA-MB-231、BT-549、BR3、MCF7中miR-409的水平进行检测。筛选适合后续实验的乳腺肿瘤细胞株进行进一步研究。在体外细胞水平过表达或敲低miR-409观察其对乳腺癌细胞增殖、侵袭能力的作用,与此同时观察SATB1蛋白及m RNA的表达水平。而后在此基础上通过反向调节SATB1的表达,阻断miR-409调控肿瘤细胞的增殖、侵袭能力,证实miR-409可通过SATB1影响乳腺肿瘤细胞的增殖和侵袭力。最后应用丙泊酚干预乳腺癌肿瘤细胞,检测细胞增殖及SATB1、miR-409表达的变化。揭示丙泊酚通过miR-409/SATB1轴调节乳腺癌细胞增殖、侵袭行为。为乳腺癌麻醉和治疗方法提供参考。本课题四部分的具体内容如下:第一部分新辅助治疗对乳腺癌患者免疫状态和SATB1基因表达的作用目的:回顾既往病例资料筛选免疫组化三阴性行新辅助治疗的乳腺癌患者,根据不同的治疗方法分组,提取治疗过程中的各项临床指标、免疫检测指标和SATB1表达。方法:选取我院三阴性乳腺癌患者资料共80例。按照纳入排除标准筛选病例,记录统计临床资料。所有患者曾接受的基础治疗均为TAC方案,联合阿帕替尼治疗的患者分至实验组。统计两组的治疗效果、免疫指标和SATB1指标差异。结果:1.两组的客观缓解率差异显著,实验组优于对照组,且两组之间的不良事件差别无统计学意义（P＜0.05）。2.实验组经治疗后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+较对照组差异明显,具有统计学意义（P＜0.05）。3.SATB1阳性表达率研究组则明显低于对照组,差异具有统计学意义（P＜0.05）。小结:本部分实验选取三阴性乳腺癌病例,治疗后检测瘤体变化和免疫指标以及SATB1等基因,分析临床治疗效果。1.新辅助化疗联合阿帕替尼治疗对三阴性乳腺癌患者效果明显。2.T淋巴细胞功能明显改善,SATB1表达明显改善,而药物不良反应无明显增加,安全、有效。3.SATB1基因、免疫状态间接反应肿瘤患者预后。第二部分miR-409调节乳腺癌细胞增殖及侵袭能力目的:基于前序SATB1为乳腺癌的一个重要标志物,结合生信分析筛选miR-409为其上游调控基因。此部分检测乳腺癌和癌旁非肿瘤组织以及MDA-MB-453、MDA-MB-231、BT-549、BR3、MCF7的miR-409表达水平,分别选取miR-409表达水平偏高的BT549以及miR-409表达水平偏低的MDA-MB-453作为研究对象,通过应用miR-409的模拟物（mimics）和抑制剂（inhibitor）调高或敲低miR-409的表达水平,观察miR-409对乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力的影响。为后续miR-409调控SATB1提供实验基础。方法:应用q RT-PCR实验方法检测乳腺组织和细胞株中miR-409表达,比较miR-409在乳腺肿瘤组织和正常乳腺组织中的表达差异。检测MDA-MB-453、MDA-MB-231、BT-549、BR3、MCF7细胞株miR-409表达水平。用miR-409 mimic以及miR-409 inhibitor分别转染乳腺癌细胞株MDA-MB-453和BT549,过表达或敲低miR-409在乳腺癌细胞中的表达水平。应用CCK-8实验的试剂盒检测细胞增殖能力的变化;通过Transwell侵袭实验评估细胞侵袭能力的变化。结果:1.乳腺肿瘤和乳腺癌细胞株miR-409表达水平乳腺癌细胞和癌旁正常组织细胞中miR-409表达水平差别具有显著性（P＜0.05）。乳腺肿瘤组织中miR-409表达水平低于正常乳腺组织;检测MDA-MB-453、MDA-MB-231、BT549、BR3、MCF7乳腺癌细胞株miR-409表达水平,筛选低表达miR-409的MDA-MB-453和高表达miR-409的BT549。2.miR-409改变乳腺癌细胞株增殖能力MDA-MB-453乳腺癌细胞株转染miR-409 mimics后相较于miR-NC组,细胞增殖能力明显下降,此差异具有统计学意义（P＜0.05）;BT549转染miR-409 inhibitor后相比于miR-NC组细胞增殖率明显上升,差异具有统计学意义（P＜0.05）。3.miR-409对乳腺癌细胞侵袭能力的影响MDA-MB-453乳腺癌细胞株转染miR-409 mimic后,细胞侵袭特性较mimic NC组下降,此差异有统计学意义（P＜0.05）。而BT549乳腺癌细胞株转染miR-409 inhibitor后,细胞侵袭能力明显高于inhibitor NC组（P＜0.05）。小结:本部分实验检测乳腺癌组织、癌旁组织和乳腺癌细胞株MDA-MB-453、MDA-MB-231、BT549、BR3、MCF7 miR-409基因的表达。过表达或敲低miR-409在乳腺癌细胞中的表达水平可以改变乳腺癌细胞增殖和侵袭能力。1.乳腺癌组织较癌旁组织miR-409表达偏低,多种乳腺癌细胞株检测miR-409:MDA-MB-453为相对低表达,BT549为相对高表达。2.转染miR-409 mimics和miR-409 inhibitor至乳腺癌细胞可有效调控miR-409水平。3.上调miR-409可明显抑制肿瘤细胞的增殖能力;敲低miR-409可明显增强乳腺肿瘤细胞的增殖能力。4.转染miR-409 mimic可降低肿瘤细胞侵袭力;转染miR-409 inhibitor可增强瘤细胞侵袭力。第三部分miR-409通过SATB1调节乳腺癌细胞的增殖及侵袭力目的:第二部分实验表明miR-409为“抑癌基因”。查阅miRBase、DIANA tools、Target Scan等生信工具提示miR-409可能为SATB1上游基因,调控其表达。本部分应用SATB1及si SATB干预miR-409 mimic和miR-409 inhibitor转染的MDA-MB-453和BT549乳腺癌细胞株,观察乳腺肿瘤细胞增殖、侵袭能力的变化。验证miR-409/SATB这一信号通路。方法:培养至最佳状态的乳腺癌细胞株:MDA-MB-453、BT-549,应用q RT-PCR方法检测肿瘤细胞miR-409表达水平,WB检测SATB1蛋白表达。乳腺癌细胞株MDA-MB-453低表达miR-409,通过转染miR-409mimics上调miR-409,并设立miR-NC转染对照组;乳腺癌细胞株BT549高表达miR-409,转染miR-409 inhibitor敲低miR-409,并设立miR-NC转染对照组;转染SATB1及si SATB至miR-409 mimic和miR-409 inhibitor转染的MDA-MB-453和BT549乳腺癌细胞株,CCK8和Transwell实验检测细胞增殖和侵袭能力变化。结果:1.miR-409可调控SATB1m RNA及蛋白表达水平与对照组相比,过表达miR-409乳腺癌MDA-MB-453细胞株中的SATB1m RNA及蛋白水平表达明显下降;与对照组相比,低表达miR-409乳腺癌BT549细胞株中的SATB1m RNA及蛋白水平明显上调。2.miR-409表达水平与SATB1表达水平呈负相关我们进一步利用q RT-PCR的方法检测乳腺癌组织中SATB1m RNA表达水平,对miR-409与SATB1的表达水平进行相关性分析,结果表明miR-409与SATB1表达水平呈负相关（R=-0.6911,P＜0.01）3.SATB1可增强miR-409mimic转染的乳腺癌MDA-MB-453细胞的增殖和侵袭能力。CCK8实验:与miR-409 mimic转染组相比SATB1可使上调miR-409的MDA-MB-453乳腺癌细胞株增殖活性加强,在培养24小时,48小时,72小时后两组建的OD值均有差异,此差异具有显著性（P＜0.01）。Transwell实验:在培养48小时后,与miR-409 mimic转染组相比,SATB1加强了上调miR-409的MDA-MB-453乳腺癌细胞侵袭活性。4.si SATB1可降低转染miR-409inhibitor的乳腺癌BT549细胞株增殖、侵袭能力。CCK8实验:与miR-409 inhibitor转染组相比si SATB1可降低敲低miR-409的乳腺癌BT549细胞株增殖活性,OD值有差异,且有统计学意义（P＜0.01）。Transwell实验:与miR-409 inhibitor转染组相比,敲低SATB1可明显降低miR-409inhibitor转染对细胞侵袭活性的促进作用（P＜0.01）。小结:通过细胞侵袭、增殖实验结果评估miR-409在体外对乳腺肿瘤细胞增殖和侵袭能力的作用。判定在体外乳腺癌细胞株内,miR-409可通过SATB1基因调控体外乳腺癌细胞的生物学行为。小结如下:1.miR-409可调控SATB1表达水平2.SATB1可增强miR-409mimic转染的乳腺癌MDA-MB-453细胞的增殖、侵袭能力。3.si SATB1可降低转染miR-409inhibitor的乳腺癌BT549细胞株增殖、侵袭能力。4.miR-409可通过SATB1调控乳腺癌细胞的增殖、侵袭能力。第四部分丙泊酚通过miR-409/SATB1抑制乳腺癌细胞增殖力目的:根据前三部分实验:SATB1可作为乳腺癌分子标志物,验证了miR-409/SATB1信号通路。本部分使用丙泊酚培养肿瘤细胞,通过Western blot、MTT、q RT-PCR方法检测乳腺癌细胞增殖和SATB1、miR-409等指标,明确丙泊酚对乳腺肿瘤细胞的增殖以及SATB1、miR-409等指标表达的影响。证明丙泊酚可通过miR-409/SATB1这一通路影响乳腺瘤细胞的生物学行为。方法:培养至最佳状态的乳腺癌细胞株:SKBR3、MDA-MB-453,分别使用2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml丙泊酚处理后、24小时、48小时、72小时MTT法检测细胞增殖情况,应用Western blot检测SATB1蛋白表达情况、q RT-PCR检测miR-409表达。结果:1.丙泊酚可影响乳腺癌细胞增殖能力:MTT法检测给予不同浓度的丙泊酚培养后乳腺癌细胞株的增殖能力,差异具有显著性,且抑制能力与丙泊酚的浓度相关（P＜0.05）。2.丙泊酚可影响乳腺癌细胞SATB1表达水平:应用Westenblot方法对比检测使用丙泊酚以及对照组干预后的乳腺癌细胞株SATB1表达水平,两组的差异有统计学意义（P＜0.05）。3.丙泊酚培养48h可上调SKBR3、MDA-MB-453细胞的miR-409表达。小结:本部分实验使用不同浓度的丙泊酚培养乳腺癌细胞:MDA-MB-453、SKBR3。应用MTT检测肿瘤细胞增殖、Westenblot检测SATB1蛋白表达水平。1.丙泊酚可抑制乳腺癌细胞的增殖能力,抑制程度和丙泊酚浓度呈正相关;2.丙泊酚可降低乳腺肿瘤细胞SATB1蛋白水平,上调miR-409表达。3.丙泊酚可经miR-409/SATB1通路抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力。结论:1.新辅助化疗对三阴性乳腺癌患者免疫状态和SATB1等作用明显,联合抗血管生成药物的新辅助方案T淋巴细胞功能明显改善,SATB1表达下调,临床预后改善。2.乳腺癌细胞较正常乳腺组织细胞miR-409表达水平明显降低。多种乳腺癌细胞株对比,BT549表达水平相对最高,MDA-MB-453、MCF7表达水平偏低,BR3、MDA-MB-231介于两者之间。3.miR-409的上调可以抑制MDA-MB-453的增殖和侵袭,miR-409的下调可以促进BT549的增殖和侵袭。miR-409可以抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭。4.miR-409表达水平与SATB1之间呈负相关,miR-409高表达可抑制SATB1水平。5.通过干预SATB1表达可阻断miR-409对乳腺肿瘤细胞增殖、侵袭能力的影响。6.丙泊酚可上调miR-409、抑制SATB1,对乳腺癌细胞增殖能力有负向调节作用综合以上实验,SATB1可作为乳腺癌的生物标志物,miR-409/SATB1通路可调控乳腺癌细胞的增殖和侵袭力,丙泊酚可经miR-409/SATB1通路抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力。