论文部分内容阅读
星状病毒（Astrovirus,Ast V）是一种单股正链RNA病毒,猪星状病毒与人星状病毒同源性较高及存在基因重组现象,具有发生基因重组的能力,是潜在的人畜共患病病原。猪星状病毒导致的腹泻主要发生在仔猪与免疫缺陷个体,猪星状病毒非结构蛋白由nsP1a和nsP1ab两个多聚蛋白切割而来,目前nsP1a各蛋白组分的功能作用尚未清楚,本研究将对nsP1a各蛋白组分进行初步探索,以nsP1a研究作为切入点,为后续猪星状病毒对先天性免疫的相应逃逸机制研究奠定实验基础。为此根据Gen Bank上PAst V1的基因序列设计一对特异性引物和Taqman探针,建立猪星状病毒I型Taqman荧光定量PCR方法。实验结果显示该方法灵敏度可检测极限为3.89×10~1copies/μL,高于常规PCR 100倍,组内、组间重复性实验变异系数均小于2%,与其他猪肠道病毒无交叉反应,随机检测30份临床样品检出率为70%,高于常规PCR方法（56.7%）。检测2021年广西地区6个猪场共170份腹泻粪便样品,猪星状病毒I型总体阳性率为44.1%,仔猪群体阳性率为57.7%。利用生物信息学软件分析猪星状病毒nsP1a多聚蛋白水解位点,建立各蛋白组分三级结构模型,预测各蛋白组分功能。分析预测表明:nsP1a水解位点位于A171/Q172、A408/A409、Q565/T566。根据三级结构模型发现nsP1a/1的97—134aa存在亮氨酸拉链结构,推测nsP1a/1为病毒的DNA结合蛋白,对病毒基因的复制转录起到相关作用。nsP1a/2的216—237aa类似flgd帽钩结构,推测nsP1a/2为病毒的跨膜蛋白。nsP1a/3的21—157aa与人星状病毒丝氨酸蛋白酶结构相符,表明nsP1a/3是病毒丝氨酸蛋白酶。nsP1a/4的26—77aa与CIN85蛋白的c端卷曲螺旋结构域类似,CIN85属于一种信号接头蛋白,推测nsP1a/4具有介导信号通路的相关能力。成功构建原核表达重组质粒nsP1a/1-p ET-32a、nsP1a/3-pCold-I、nsP1a/4-p ET-32a,转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达nsP1a/1、nsP1a/3、nsP1a/4重组蛋白,经SDS-PAGE鉴定均为包涵体形式存在。纯化后的重组蛋白免疫健康新西兰大白兔,成功制备nsP1a/1、nsP1a/3、nsP1a/4多克隆抗体,通过WB鉴定多克隆抗体均具有特异性识别能力。成功构建真核表达重组质粒pCAGGS-MCS-nsP1a/1、pCAGGS-MCS-nsP1a/3、pCAGGS-MCS-nsP1a/4,分别通过脂质体转染293T细胞。利用实验四制备的多克隆抗体进行WB鉴定,结果表明nsP1a/1、nsP1a/3、nsP1a/4重组蛋白能够在293T细胞中表达。利用q PCR检测不同时间点IL-6、TNF-α的m RNA水平并与空载对照组比较倍数,实验结果显示nsP1a/1组TNF-α在6—36h逐渐上调（为空载对照组的0.2倍—3.3倍）,但倍数低;IL-6各时间点与空载对照组相持平,与PAst V1感染PK-15的TNF-α和IL-6 m RNA变化趋势不相符,表明nsP1a/1过表达没有引起炎性因子的显著变化,推测其并不参与PAst V1感染产生的炎症反应。nsP1a/3组、nsP1a/4组的TNF-αm RNA水平随时间增加呈现上升的趋势,在24h时到达最高随后有所下降,与PAst V1感染PK-15细胞的TNF-αm RNA变化趋势相一致。nsP1a/3组IL-6在24h被抑制,nsP1a/4组IL-6在6—36h被抑制,与PAst V1感染感染PK-15细胞的IL-6促进上调呈现相反的结果。表明nsP1a/3、nsP1a/4参与炎性反应,推测nsP1a/3、nsP1a/4过表达影响NF-κB信号通路,干扰抑制IL-6促炎细胞因子的转录。pCAGGS-MCS空载、pCAGGS-MCS-nsP1a/1、pCAGGS-MCS-nsP1a/3、pCAGGS-MCS-nsP1a/4分别转染PK-15细胞,24h后感染PAst V1（0.01MOI）,利用猪星状病毒I型Taqman荧光定量PCR方法检测感染后12h、24h病毒RNA拷贝数并与空载对照组比较差异性。实验结果显示,过表达nsP1a/1细胞中12—24h病毒复制增长率为29.8%,高于nsP1a/3组（18.8%）、nsP1a/4组（13.1%）、空载对照组（20.8%）。过表达nsP1a/4组12h细胞中病毒载量为3.89×104.72copies/μL,显著高于nsP1a/1组(3.89×102.83copies/μL)、nsP1a/3组(3.89×103.28copies/μL)、空载对照组(3.89×102.83copies/μL)。实验结果表明nsP1a/1对病毒复制有促进作用,初步验证实验二对nsP1a/1为病毒DNA蛋白的预测。nsP1a/4的过表达有利于病毒的感染并可以干扰抑制IL-6的转录,在蛋白结构上具有潜在介导信号通路能力,初步推断nsP1a/4在PAst V1先天性免疫逃逸机制发挥相关作用。