传染性喉气管炎（Infectious laryngotracheitis,ILT）是由传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus,ILTV）引起的鸡高度传染性呼吸道疾病。ILTV感染不仅可引发上呼吸道损伤,还会导致生长性能降低,例如体重增加减少和产蛋量下降。ILTV属α疱疹病毒亚科的成员,近期研究发现其他α疱疹病毒的pUL56蛋白是一种毒力因子。尽管ILTV pUL56蛋白与其他疱疹病毒的同源物具有高度同源性,但ILTV pUL56的生物学功能尚未报道。由于目前商品化的ILT疫苗提供的免疫保护是有缺陷的,免疫过的鸡群仍可以被ILTV强毒株感染。因此,亟需了解ILTV pUL56蛋白在体外的时间和空间上的表达特征,并确定其表达是否与致病机制相关。本研究将有助于选择合适的疫苗并制定预防和控制ILT的疫苗接种策略。ILTV编码的pUL56蛋白在进化上高度保守,但其功能仍知之甚少。为探究pUL56蛋白的表达及功能,本研究通过多肽免疫制备了ILTV pUL56特异性多克隆抗体（p Ab）。预测pUL56的抗原表位位于30DPHQDDFPRDADSPN44区段,具有良好的可及性、亲水性和免疫原性,因此化学合成相应的氨基酸序列作为免疫原。用合成的多肽免疫兔子至免疫程序结束后,收获抗血清并进行亲和层析以获得纯化的抗体。用表达pUL56蛋白的重组质粒转染HEK293T细胞,通过IFA和Western blot验证了ILTV pUL56特异性抗体的反应性和特异性。综上,这些结果表明制备的多克隆抗体可以特异性识别pUL56蛋白的表达。为探究pUL56蛋白的表达谱及其亚细胞定位分布,本研究构建了野生型pUL56（WT）及其关键结构域的突变体质粒pUL56（AY）和pUL56（△TMD）,经Western blot检测证实这些质粒在转染细胞内正确表达。以5 000 EID50/m L的ILTV K317株及Serva株病毒分别感染鸡胚肾细胞（CEK）和气管环（TOC）后,利用兔抗pUL56特异性多克隆抗体通过Western blot检测pUL56蛋白的表达变化,结果显示两种不同感染体系的表达谱存在明显差异,但不同毒株蛋白表达变化相似。CEK中的pUL56蛋白从感染后24 h开始表达,48 h达到高峰后逐渐下调;相反,pUL56蛋白在TOC中的表达量持续上升。将pUL56（WT）、pUL56（AY）和pUL56（△TMD）分别转染HEK293T细胞后瞬时表达pUL56及其突变体,经高尔基体标志蛋白58k、内质网标志蛋白、细胞膜标志蛋白的抗体孵育,通过激光共聚焦试验进行亚细胞定位分析,结果显示pUL56蛋白亚细胞定位受跨膜域影响,主要分布于高尔基体。为探究地方品种鸡对不同ILT弱毒活疫苗株的免疫应答反应,本研究用两种商品化的疫苗K317株和Serva株分别免疫1日龄试验三黄鸡群。在免疫后3 dpi、5 dpi、7 dpi,通过实时定量PCR检测喉拭子病毒载量,检测病毒UL56基因在喉头、气管、结膜、哈德氏腺、肺脏、法氏囊、胸腺、脾脏、盲肠扁桃体、肾脏等组织内的表达水平,并采集抗凝血检测细胞因子的m RNA表达量,最后统计免疫器官指数。实验结果显示,K317株病毒载量呈稳定上升趋势;相反,Serva株呈稳定下降趋势。在3 dpi,两疫苗株的UL56基因在喉头、气管、盲肠扁桃体表达量较高,在5 dpi,K317株的UL56基因在喉头中表达量较高,在7 dpi,Serva株的UL56基因在哈德氏腺、盲肠扁桃体中表达量较高。两组疫苗免疫后引起的法氏囊、胸腺和脾脏等免疫器官变化无明显差异。在免疫K317株组中,3 dpi时鸡只的IL-8、IL-8L1、IFN-α、IFN-γ基因表达明显上调,在免疫Serva株组中,7 dpi时鸡只的IL-8基因表达明显上调。综上所述,本研究揭示了ILTV pUL56不同于其他α疱疹病毒中pUL56同源蛋白的表达特征。此外,确定了影响ILTV pUL56亚细胞定位的关键结构域。这些发现将有助于进一步研究ILTV pUL56蛋白的分子相互作用和生物学功能。此外,本研究的结果也提示,不同ILT疫苗引起的三黄鸡免疫反应差异可能与毒株的UL56基因表达有关。这些发现为今后优化和设计新型ILT疫苗提供了科学依据,也为临床上地方品种鸡合理选择ILT商品疫苗提供了数据参考。