目的:癌毒病机理论认为,结直肠癌是在脾气亏虚,肠腑失调的基础上,癌毒与湿、热、瘀等病邪搏结于肠道而形成的恶性肿块,“湿热瘀毒证”是结直肠癌的核心证候,仙连解毒方是癌毒病机理论指导下治疗结直肠癌湿热瘀毒证的临床有效验方。本研究采用单细胞转录组测序（single cell RNA-sequencing,scRNA-seq）技术绘制氧化偶氮甲烷（Azoxymethane,AOM）/葡聚糖硫酸钠（Dextran sulfate sodium,DSS）、高温高湿环境与高脂饮食联合诱导的结直肠癌湿热瘀毒证模型小鼠的肠道细胞图谱,研究仙连解毒方治疗结直肠癌湿热瘀毒证的作用机制。方法:30只雄性C57BL/6N小鼠随机分为正常组、模型组、给药组,每组10只。模型组和给药组小鼠采用高温高湿环境、高脂饮食与AOM/DSS联合诱导建立结直肠癌湿热瘀毒证小鼠模型,正常组给予正常饮食。3个循环的DSS饮水结束后,仙连解毒方组开始给予仙连解毒方12.9g.kg-1灌胃,正常组及模型组灌胃体积相同的生理盐水,每周6天,每天1次,连续给药16周。末次给药结束,取各组小鼠结直肠组织与血清样本。造模后,每日观察小鼠生存状况,测量小鼠体重,进行疾病活动指数（Disease Activity index,DAI）评分;测量小鼠肿瘤数目,体积,试剂盒检测小鼠肠道组织髓过氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）、小鼠血清二胺氧化酶（Diamine Oxidase,DAO）的含量;苏木素-伊红染色（Hematoxylin-Eosin,HE）和亚甲基蓝染色观察小鼠结直肠的组织病理形态;取距肛门6cm的远端结肠段2cm,解离组织样本,分离单细胞悬液,提取RNA行qPCR扩增,进行scRNA-seq,采用CellRanger-v5.0.0进行数据质控,Seurat-v3.1.1软件包进行降维聚类分析,SingleR-v1.4.1、人工分析进行细胞类型鉴定、细胞亚型分类,对差异基因行生物学功能和信号通路分析,采用qPCR、免疫组化对差异基因进行验证。结果:1.造模期间,模型组小鼠体重明显下降,给药组小鼠与模型组相比无明显变化。DAI评分结果显示,模型组小鼠出现明显的稀便、便血等症状,DAI评分升高,仙连解毒方给药后,以上症状得到显著改善,DAI评分明显降低;仙连解毒方给药后可显著减少结直肠肿瘤数目、体积,改善肠道黏膜充血水肿情况;模型组小鼠DAO、MPO水平显著升高（P＜0.01）,仙连解毒方给药后,二者水平显著降低（P＜0.01）;HE染色结果显示仙连解毒方可显著减少结直肠损伤和异性增生,亚甲基蓝染色结果表明仙连解毒方可以显著抑制畸形隐窝灶（Aberrant crypt foci,ACF）的发生（P＜0.01）。2.单细胞转录组测序共捕获三组小鼠肠道细胞45480个,经质控过滤后,正常组、模型组、给药组高质量细胞数分别为9308,9393,10783个;降维聚类将所有细胞归为20个细胞群,采用SingleR-v1.4.1包参考数据集分析得出小鼠肠道细胞主要包括9种细胞类型:肠上皮细胞、B细胞、NKT细胞、天然淋巴细胞、干细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、成纤维细胞。模型组小鼠较正常组小鼠肠道组织中B细胞、NKT细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、成纤维细胞等占比上升,肠上皮细胞占比显著下降;给药组小鼠较模型组小鼠肠道组织中肠上皮细胞占比上升,B细胞、NKT细胞、巨噬细胞、中性粒细胞占比下降。根据标记基因鉴定细胞类型将小鼠肠道细胞分为6种:肠上皮细胞、T细胞、B细胞、成纤维细胞、髓系细胞、红系细胞,模型组小鼠较正常组小鼠肠道组织中肠上皮细胞、成纤维细胞占比下降,B细胞、T细胞、髓系细胞占比上升,给药组小鼠较模型组小鼠肠道组织中肠上皮细胞、成纤维细胞、红系细胞占比上升,B细胞、T细胞、髓系细胞占比下降。3.基于细胞类型人工鉴定结果进行细胞亚型分析,肠上皮细胞可分为肠嗜铬细胞、肠黏膜细胞、杯状细胞、祖细胞、干细胞、过渡增殖细胞、Tuft细胞7种亚型;T细胞可分为CD4+T细胞、CD8+T细胞、NKT细胞、γδT细胞4种亚型;B细胞可分为初始型B细胞、浆细胞2种亚型;髓系细胞可分为巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞4种亚型。同时,将 CD4+T 细胞分为 ActivatedCD4T、EffectorCD4T、MemoryCD4T、NaiveCD4T、Treg 细胞 5 种亚型;CD8+T 细胞可分为 CytotoxicCD8T、ExhaustedCD8T、MemoryCD8T、NaiveCD8T细胞4种亚型。比较三组小鼠细胞亚型比例显示,仙连解毒方可通过调控杯状细胞、肠粘膜细胞、干细胞、EffectorCD4T细胞、CytotoxicCD8T细胞、γδT细胞、初始型B细胞、浆细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞等细胞亚型比例和数量发挥治疗结直肠癌的功效。4.差异基因分析显示,结直肠癌湿热瘀毒证模型小鼠与正常小鼠相比增加261个基因表达、降低563个基因表达;仙连解毒方给药后增加模型组中229个基因表达、抑制173个基因表达。仙连解毒方主要调控钙结合蛋白A8（S100A8）、钙结合蛋白A9（S100A9）、分化簇52（CD52）、主要组织相容性复合物II类的恒定链（CD74）、酶原颗粒蛋白16（ZG16）、转录激活因子3（Atf3）、角蛋白8（Krt8）（P＜0.01）等基因的表达,GO与KEGG富集分析显示,仙连解毒方对结直肠癌湿热瘀毒证的作用主要富集在免疫系统过程、抗原处理和呈递、适应性免疫反应等方面,其主要涉及免疫系统、能量代谢、转运和分解代谢等信号通路。仙连解毒方对湿热瘀毒证结直肠癌T细胞功能影响主要集中在RNA聚合酶Ⅱ对转录的正向调控、转录因子AP-1复合物等,对T细胞通路的影响主要集中在TNF信号通路、MAPK信号通路、IL-17信号通路、Th1和Th2细胞分化等;对B细胞功能影响主要集中在对环己亚胺的细胞反应、内质网伴侣复合体、核小体的DNA结合等,对B细胞通路的影响主要集中在内质网中的蛋白质加工、癌症中的转录失调、癌症中的micRNAs等;对髓系细胞功能的影响主要集中在炎症反应、中性粒细胞趋化性、肿瘤坏死因子细胞反应等,对髓系细胞通路的影响主要集中在IL-17信号通路、TNF信号通路、NF-kb信号通路等;对红系细胞功能的影响主要集中在ATP合成耦合电子传递、细胞铁离子稳态、二价铁绑定等,对红系细胞通路的影响主要集中在铁死亡、矿质营养吸收等;对成纤维细胞功能的影响主要集中在机械刺激的反应、炎症反应负性调节、内皮细胞增殖负调控等,对成纤维细胞通路的影响主要集中在蛋白质消化吸收、内质网中的蛋白质加工、PI3K-Akt信号通路等。结论:仙连解毒方可有效抑制结直肠癌湿热瘀毒证的进展,通过调控肠上皮细胞、B细胞、T细胞、髓系细胞等多种细胞类型比例,发挥多靶点、多功能、多通路的作用机制治疗结直肠癌,其中尤其与调控结直肠癌湿热瘀毒证小鼠肠道组织中淋巴细胞、髓系细胞比例从而改善免疫、炎性微环境,抑制结直肠癌EMT密切相关。