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越来越多的研究证明苦瓜及苦瓜籽中存在着具有降血糖活性的多肽类物质。本课题主要目的为:(1)分离纯化苦瓜籽中的降糖活性多肽组分PA和蛋白水解酶抑制剂组分,并对PA和抑制剂组分进行药效学分析;(2)由PA和抑制剂组分经合理配伍后制成苦瓜多肽胶囊产品,并对产品进行质量研究,建立质量分析方法和质量标准。
采用酸醇提取工艺从苦瓜籽中分离纯化降糖活性多肽组分PA。SDS-PAGE分析表明PA的分子量约为6000-8000道尔顿;紫外吸收扫描的最大吸收波长为275nm;PA易被糜蛋白酶和胃蛋白酶降解,亦能被胰蛋白酶降解,但降解程度低于糜蛋白酶和胃蛋白酶;以PAS(高碘酸-希夫)反应为原理的糖蛋白鉴别分析表明PA不是一种糖蛋白。
采用缓冲液抽提方法从苦瓜籽中提取蛋白水解酶抑制剂组分。SDS-PAGE分析表明抑制剂有10000、20000和28000道尔顿三种,其中主要组分为10000道尔顿。胰蛋白酶抑制活性测定表明其抑制剂活性可达1153.34μ/mg,糜蛋白酶抑制活性单位为14.01μ/mg。抑制剂活性测定方法学研究表明,采用本研究建立的胰蛋白酶抑制测定法比Hiroshi等采用的方法更佳。
对纯化的两种多肽组分的药理研究表明,PA经皮下注射和尾静脉注射四氧嘧啶造模的高血糖模型小鼠后,显示出显著的降血糖效果(p<0.01或p<0.05),降糖程度分别可达26.5%和37.3%,但口服则无明显的降糖效果;蛋白酶抑制剂组分经小鼠尾静脉注射和灌胃口服两种方式给药,模型小鼠均无显著的降血糖效应;将PA与蛋白酶抑制剂组分配伍混合后灌胃口服21天,试验组具有显著的降血糖效果(p<0.01或p<0.05),降糖幅度约为30%。经初步研究,PA与抑制剂最佳降血糖效应的配伍比为2:1(冻干粉重量比)。
根据药效学试验结果,采用肠溶型空心胶囊制备苦瓜多肽胶囊。对制备的胶囊产品进行初步质量稳定性研究。建立了以茚三酮显色反应、紫外波长扫描、水份含量测定、装量和微生物限度检查、蛋白含量测定、抑制剂活性测定等为指标的苦瓜多肽胶囊质量标准和有关检测方法。对苦瓜多肽胶囊的3个月稳定性考察表明,该产品3个月内各项检测指标均正常。
本研究的创新点有:(1)采用同一批原料,两条不同的纯化路线,同时分离纯化苦瓜降血糖PA多肽组分和蛋白酶抑制剂组分;(2)首次将降糖活性组分PA与蛋白酶抑制剂组分配伍,经灌胃口服仍能保持降血糖效果,制备成具备口服活性的苦瓜多肽胶囊;(3)建立了一种新的苦瓜蛋白酶抑制剂活性测定方法;(4)建立了苦瓜多肽胶囊的药品质量标准和质量控制方法。