【摘 要】
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目的:三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）是一种缺乏雌激素受体（estrogen receptor,ER）、孕激素受体（progesterone receptor,PR）以及人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）表达的侵袭性乳腺癌,其全身治疗仍然局限于化疗,并且预后较差。越来
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目的:三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）是一种缺乏雌激素受体（estrogen receptor,ER）、孕激素受体（progesterone receptor,PR）以及人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）表达的侵袭性乳腺癌,其全身治疗仍然局限于化疗,并且预后较差。越来越多的研究表明,长链非编码RNA（long non-coding RNAs,lncRNAs）参与三阴性乳腺癌的病理生理过程,从而调控癌症进展。我们之前的研究已经证明了lncRNA MILIP（c-Myc-Inducible Long noncoding RNA Inactivating P53,MILIP）通过抑制肿瘤抑制基因p53在促进肿瘤发生中的功能意义,在这里,我们旨在探讨MILIP在三阴性乳腺癌中的表达情况及其生物学作用。方法:1.采用实时荧光定量PCR（qPCR）检测不同类型乳腺癌细胞株中MILIP的表达情况。2.设计针对MILIP的特异性siRNA,通过瞬时转染将MILIP-siRNA.1及MILIP-siRNA.2分别转入到三阴性乳腺癌细胞株中,敲低MILIP后采用CCK8检测细胞活力变化,同时用克隆形成实验来判断敲低MILIP前后TNBC细胞的增殖能力变化,并且通过小鼠异种移植模型进一步验证,同时利用流式细胞仪分析敲低MILIP前后细胞周期及细胞凋亡的变化情况。3.通过慢病毒（shRNA）转染技术构建诱导敲低MILIP的MDA-MB-231.sh MILIP及HCC 1806.sh MILIP细胞株,同时采用q PCR检测诱导敲低效率。4.通过ChIP、双荧光素酶报告实验等方法寻找调控MILIP表达的上游转录因子。5.采用质谱（MS）分析、Western blot、Biotin RNA pull-down（RPD）以及RNA immunoprecipitation（RIP）等实验寻找与MILIP相结合的蛋白质,并探索其相互作用的机制。结果:1.通过qPCR检测发现MILIP在三阴性乳腺癌细胞株中的表达高于其它类型的乳腺癌细胞株,且高于正常乳腺上皮细胞,P＜0.0001,差异具有统计学意义。2.将si-MILIP.1及si-MILIP.2分别转染至细胞48小时后,q PCR检测发现与对照组相比,实验组MILIP的表达量低于对照组（P＜0.0001）;CCK8以及克隆形成等实验结果均显示敲低MILIP后,细胞数目明显减少,细胞增殖活性明显降低（P＜0.0001）。3.通过构建异种移植小鼠模型,我们发现相比较对照组,诱导敲低MILIP后可使肿瘤增长缓慢,回复其表达后肿瘤恢复增长。4.通过对细胞周期的检测,敲低MILIP组的细胞与对照组相比可发现其G0/G1期的细胞百分比显著增加。5.在前期研究基础上,通过ChIP、双荧光素酶报告实验以及后续的Western blot实验发现,敲低c-Myc可以使MILIP的表达下降,过表达c-Myc可以提高MILIP的表达。6.根据质谱结果及RPD、RIP实验发现eEF1A1与MILIP相结合,敲低MILIP可以减少eEF1A1与tRNA的结合,从而影响细胞内整体新生蛋白的合成。结论:综合上述实验结果我们得知,MILIP在三阴性乳腺癌细胞株中的表达显著增高,c-Myc调控MILIP的表达,敲低MILIP可以显著抑制细胞增殖,将细胞周期阻滞到G0/G1期,后续实验表明MILIP的作用是促进tRNA和eEF1A1之间的结合,从而促进细胞内整体蛋白质的合成。关于MILIP介导的促进tRNA与eEF1A1之间相互作用的结构功能基础的研究仍在进行中,同时我们还将探究MILIP靶向TNBC治疗的治疗潜力。
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