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目的氟罗沙星(Fleroxacin,FLE)是在医学临床以及动物饲料添加剂中广泛应用的一种氟喹诺酮类抗菌药物,由于其广谱抗菌作用,在动物源性食品及药品中过度使用导致残留量过高,严重威胁人类的身体健康,进一步加强监测并提高其检测方法很有必要。本研究旨在构建天然鼠源噬菌体抗体库,从中筛选氟罗沙星单链抗体并进行表达与鉴定。基于基因工程方法制备的重组抗体作为第三代抗体,生产周期短且容易改造,为快速低成本制备目的抗体提供了新的方法。方法1.选用未经免疫的健康Balb/c小鼠,提取总细胞RNA,反转录为cDNA作为模板,经RT-PCR扩增出抗体的重链可变区与轻链可变区基因,经重叠延伸PCR用Linker(Gly4Ser)3连接,组装成为单链抗体基因,并引入Sfi Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点。双酶切目的片段与噬菌粒pCANTAB5E并连接,电转化E.coli TG1,构建出初级噬菌体抗体库。2.合成氟罗沙星的人工抗原,以FLE-OVA为包被原对抗体库进行三轮富集筛选,随机选择10株单克隆进行phage-ELISA鉴定及基因测序。3.氟罗沙星单链抗体和pET-32a载体经BglⅡ和HindⅢ限制酶消化后,用T4连接酶将FLE-ScFv插入pET-32a载体。转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株并在LB培养基中震荡培养至OD600达到0.7,加入1.0 mmol/L IPTG置于20℃摇床诱导表达10h。离心收集菌体用PBS重悬,超声破碎后收集上清与沉淀,磁珠纯化后SDS-PAGE与Western blot分析蛋白表达,ELISA鉴定效价与抑制。结果1.扩增出340bp的抗体重链可变区与320bp的抗体轻链可变区基因,拼接获得约750bp的单链抗体片段,成功构建库容量大小为2.1 ×1011的初级噬菌体抗体库。2.成功合成氟罗沙星的人工抗原,以FLE-OVA为包被原对抗体库进行三轮富集筛选结果表明:噬菌体回收率逐轮增高,抗体库得到了有效的富集。phage-ELISA结果表明:成功筛选得到能够与FLE-OVA特异性结合的氟罗沙星单链抗体。3.纯化后的FLE-ScFv的SDS-PAGE与Western blot结果表明:抗体在大肠杆菌中主要为包涵体表达,获得大小约47kD的目的条带。基因测序结果经Ediseq序列分析,与单链可变区抗体基因的结构与特征相符。间接竞争ELISA鉴定结果:标准曲线回归方程的线性相关系数≥0.99,IC50为42ng/ml,能够检测出国家规定的氟罗沙星残留标准低限值以下的食品药品残留。结论本研究成功构建天然噬菌体单链抗体库,筛选获得能够与氟罗沙星特异性结合的单链抗体,为抗体的快速制备与检测以及食品药品残留的分析提供了技术支持。