叶绿体是高等植物最关键的组成部分,因为它是唯一可以将太阳能吸收转化为化学能供机体维持生命的细胞器。因此叶绿体的分化、发育和功能对于地球上的生命物质来说是至关重要的。超过90%的叶绿体蛋白都是由核基因组编码,然后再被特定的转运子运进叶绿体内的。在叶绿体中他们与质体编码的蛋白一起组装形成有功能的光合代谢复合物,因此前质体到叶绿体的分化是一个需要核-质基因协作的精细调控过程。在整个质体发育的复杂网络中,任何一个相关基因的改变都有可能导致叶绿体发育的异常,从而产生不同类型的叶色突变体。叶绿体最主要的代谢活动是进行光合作用,所以其主要功能是产生供生命有机体维持生长的能量物质ATP。然而由于ATP本身大小和电荷的原因,不能有效的在各个生物膜上进行穿梭,因此为了将ATP运送到其他异养细胞器就产生了特定的转运蛋白。目前为止,已鉴定出三类ATP转运蛋白,第一类转运蛋白是ATP/ADP携带蛋白(ATP/ADP carrier,AAC),属于线粒体转运家族(mitochondrial carrier family,MCF),AAC是首个被详细研究的MCF家族成员。第二类转运蛋白是质体核苷酸转运子(plastidial nucleotide translocator,NTT),其结构上与MCF家族蛋白具有较大区别。第三类是最近几年又鉴定出的另外一种MCF类型的ATP/ADP转运蛋白Brittle1,简称BT1。BT1在玉米中首次被报道,因其突变体表现出籽粒粉质脆弱的表型,才由此将该基因命名为Brittlel。在拟南芥、马铃薯、大麦和苜蓿等植物中相继克隆了同源的BT1基因,并验证了其转运核苷酸及其衍生物的功能。但是目前为止,水稻中仍然没有克隆BT1基因,对于这个第三类核苷酸转运蛋白功能的研究仍然是一片空白。在本研究中,我们鉴定并克隆了一个新的MCF类型的ATP/ADP转运蛋白OsBT3,该蛋白对于水稻叶片早期的叶绿体发育具有重要作用。OsBT3基因单碱基的缺失导致了苗期白色条纹叶片的产生,同时伴随着叶绿体发育的异常,降低的光合效率和叶绿素含量。OsBT3是一个位于叶绿体上的转运蛋白,同时又与PORA在叶绿体上产生互作,促进PORA蛋白的稳定和其功能的发挥。本研究提出了 OsBT3在水稻叶绿体发育中新的功能,为丰富叶绿体的发育机制和BT家族功能的多样性提供了依据。主要研究结果如下:1)wsl2突变体与野生型相比主要表型上的差异:苗期叶片在五叶期以前呈现明显的白条纹,在第三叶上表型最严重,第五叶开始恢复正常,叶绿素含量与叶片表型相对应;前质体中没有典型的PLB结构,叶绿体分化发育滞后于野生型,结构异常;光合效率和电子传递速率下降,千粒重、株高显著下降;多种质核基因信号传导路径受到影响,编码叶绿素合成与质体发育相关的基因表达量下降;原脱植基叶绿素氧化还原酶PORA活性下降,ROS大量积累。2)遗传分析表明,wsl2属于单基因隐性突变。通过图位克隆鉴定到目的基因OsBT3由于单碱基的缺失产生了移码突变,最终翻译提前终止;目标基因是一个假定的MCF家族成员,同源基因之间氨基酸序列相对保守,具有三个线粒体能量转运信号(METs)结构域、六个跨膜结构域,另外还有一些重要的半胱氨酸残基;进化枝的分析将该基因分为第二类BT蛋白,即可能是一个ATP/ADP转运蛋白;水稻中有三个BT同源基因,其各自表达形式不同;将OsBT3基因构建到RNAi干扰载体中,转基因家系出现了类似突变体的白条纹表型,且叶绿素含量显著下降,光合基因的表达水平均下调。3)OsBT3是一个叶绿体ATP/ADP转运蛋白。亚细胞定位结果显示出OsBT3定位于叶绿体;体外转运实验发现OsBT3对ATP/ADP具有较高的亲和力;在突变体叶绿体中检测到了高于野生型的ATP含量;体外添加ATP可诱导质体发育相关基因的表达。4)OsBT3对PORA的稳定性具有保护作用。OsBT3可以与叶绿素合成路径中的脱植基叶绿素氧化还原酶NADPH:PORA在叶绿体膜上产生互作;同时OsBT3蛋白在热激和氧化胁迫条件下可以维持PORA蛋白的稳定性;在野生型中体内和体外实验均检测到了更加稳定的PORA蛋白,且发现OsBT3可能对PORA蛋白的积累产生正向的调控作用。5)OsBT3对PORA的保护活性依赖于核苷酸结合位点。在OsBT3蛋白的保守位点,即ATP/ADP结合位点创造了点突变,结果该蛋白失去了转运ATP的能力;点突变的蛋白对PORA不再具备保护功能。上述实验说明,OsBT3对PORA的保护作用依赖于其本身的ATP/ADP结合位点,显示了腺苷转运蛋白在功能上的另外一些可能性,为我们更加全面了解MCF家族的功能提供了崭新的思路。