猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus,PRRSV)引起的一种病毒性传染病,临床上主要表现为妊娠母猪的繁殖障碍和仔猪的呼吸道疾病,因其可引起发病猪耳部发绀成蓝紫色,俗称蓝耳病。目前我国流行的高致病性蓝耳病(highly pathogenic PRRS,HP-PRRS)比经典PRRS致病性更高,危害更大。虽然对PRRSV进行了广泛的研究,但决定其复制和毒力等的相关机制尚不够清楚。感染性克隆是研究PRRSV的重要操作平台,目前大部分的PRRSV感染性克隆是基于体外转录的,这不仅降低了拯救的效率,而且增加了病毒拯救的复杂程度。为高效快速地拯救PRRSV,本研究开展了基于真核启动子的PRRSV反向遗传的构建。通过RT-PCR方法分段扩增了高致病性PRRSV HuN4-F5和经典PRRSV CH-1a的全长基因组片段,克隆至含β-actin真核启动子的低拷贝载体pOKM中,成功构建了pOK-HuN4和pOK-Ch两个全长基因组克隆,经直接转染Marc-145细胞,成功拯救出相应的病毒。其中pOK-CH的成功构建为PRRSV CH-1a株的保种提供了保证。同时在pOK-HuN4和pOK-CH的基础上,分别对其结构蛋白和非结构蛋白进行互换,构建了6株嵌合病毒,即以结构蛋白互换的pOK-HuN4nsp-CHsp和pOK-CHnsp-HuN4sp,非结构蛋白开放阅读框互换的pOK-HuN4-CHORF1a、pOK-CH-HuN4ORF1a、pOK-HuN4-CHORF1b和pOK-CH-HuN4ORF1b,并成功拯救出这6株嵌合病毒。在pOK-HuN4的基础上在其ORF7和3’-UTR之间插入海肾荧光素酶报告基因,经拯救后,可检测到荧光信号,为PRRSV的复制监测及中和抗体水平检测等方面提供了应用技术。基于真核启动子的HP-PRRSV HuN4和PRRSV CH-1a株感染性克隆的构建,避免了RNA的体外转录,简化了病毒的拯救过程,提高了病毒拯救的成功率。在此基础上完成了带有海肾荧光素酶报告基因的pOK-HuN4-Rlu以及一系列嵌合毒的构建为今后研究影响PRRSV复制和毒力基因提供了操作平台,同时pOK-HuN4-Rlu的构建也为监测PRRSV复制以及中和抗体的检测提供了技术支持。