【摘 要】
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目的:探究PCV2在感染DC过程中,所产生的VDEX对脾淋巴细胞增殖作用的影响。方法:1.为获得Mo DC,并建立PCV2感染Mo DC模型。首先分离猪PBMC,使用含有rp IL-4和rp GM-CSF的培养基在体外对PBMC进行诱导分化,显微镜逐天观察分化情况;在诱导分化144 h后,收获悬浮细胞,流式细胞技术检测细胞表面标志物SWC3和CD1;在Mo DC培养体系中加入PCV2（MOI=1.
【基金项目】
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山西省重点研发计划项目（201903D421037）； 山西农业大学科技创新基金项目（2016014）；
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目的:探究PCV2在感染DC过程中,所产生的VDEX对脾淋巴细胞增殖作用的影响。方法:1.为获得Mo DC,并建立PCV2感染Mo DC模型。首先分离猪PBMC,使用含有rp IL-4和rp GM-CSF的培养基在体外对PBMC进行诱导分化,显微镜逐天观察分化情况;在诱导分化144 h后,收获悬浮细胞,流式细胞技术检测细胞表面标志物SWC3和CD1;在Mo DC培养体系中加入PCV2（MOI=1.0）培养48 h,IFA检测Mo DC是否被PCV2感染。2.通过NTA技术、TEM技术以及WB技术分别对超高速离心获得的EVs进行粒径、形态和蛋白标志物的鉴定。确定通过超高速离心法获得的EVs是否为Exo。3.采用PCR检测VDEX中的PCV2;并在PK-15细胞的培养体系中加入VDEX,IFA技术检测PCV2能否通过Exo感染PK-15细胞。4.将DEX和VDEX分别加入到CFSE标记的猪脾淋巴细胞培养体系中。在分别培养24 h、48 h和72 h后,采用流式细胞技术检测DEX和VDEX对脾淋巴细胞增殖的影响。5.通过Illumina测序技术,对DEX和VDEX中的mi RNA进行测序,生物信息学分析具有表达差异的mi RNA,确定可能参与VDEX诱导淋巴细胞增殖的目标mi RNA。6.通过q PCR技术,对DEX和VDEX中目标mi RNA的相对表达量进行检测。结果:1.PBMC经诱导分化后的细胞具有树枝状突出,并出现“浮萍”样细胞集落;流式细胞术结果显示,细胞表型SWC3和CD1双阳性率达到98%,获得了符合试验要求的Mo DC;IFA结果显示,与PCV2共孵育的Mo DC中有特异性绿色荧光。结果表明,PCV2感染Mo DC模型建立成功。2.NTA和TEM分析结果显示,获得的EVs直径分别为130 nm和120 nm,形态呈圆形或椭圆形盘状,为双层膜的囊泡;WB结果显示,获得的EVs存在特异性标记蛋白CD63和TSG101。结果表明,通过超速离心法提取的EVs为Exo。3.PCR结果显示,VDEX中含有PCV2;IFA结果显示,PK-15细胞中有特异性绿色荧光。结果表明,PCV2可以通过VDEX感染PK-15细胞。4.流式细胞仪对细胞增殖检测结果显示,在24 h和48 h,与细胞对照组相比,DEX组的细胞增殖率变化不显著（均为P＞0.05）,VDEX组的细胞增殖率显著增加（均为P＜0.05）,DEX组和VDEX组之间细胞增殖率差异不显著（均为P＞0.05）;在72 h,与细胞对照组相比,DEX组和VDEX组的细胞增殖率均显著增加（P＜0.05）,和DEX组比较,VDEX组细胞增殖率显著增加（P＜0.05）。结果表明,DEX和VDEX均可促进脾淋巴细胞的增殖,并且VDEX的促增殖作用强于DEX。5.对DEX与VDEX中mi RNA进行测序,共得到18636987条序列,其中有效序列6356221条,已知mi RNA 625种,未命名的新mi RNA 283种。表达差异显著mi RNA共有509种（P＜0.05）,其中161种表达上调,348种表达下调。对差异mi RNA进行靶基因预测,筛选具有显著性的靶基因有13204个（P＜0.05）。通过GO富集分析和KEGG富集分析得到显著性GO条目1752条（P＜0.05）,显著性KEGG通路203条（P＜0.05）。通过差异mi RNA显著性P值、Fold-change和KEGG富集分析,最终确定出ssc-mi R-10b、ssc-mi R-199a-3p-R-1、ssc-mi R-532-5p、ssc-mi R-425-5p、ssc-mi R-210、ssc-mi R-144-R+1、ssc-let-7c、ssc-mi R-107-R-2、ssc-mi R-22-5p-R-1和ssc-mi R-296-3p-R+1这10个目标mi RNA。6.对10个目标mi RNA在DEX和VDEX中的相对表达量进行q PCR检测,结果发现ssc-mi R-532-5p、ssc-mi R-425-5p、ssc-mi R-210、ssc-mi R-144-R+1、ssc-let-7c、ssc-mi R-107-R-2、ssc-mi R-22-5p-R-1和ssc-mi R-296-3p-R+1的q PCR结果与测序结果一致,在VDEX中表达量显著下降（P＜0.05）。结论:VDEX中携带PCV2,可能是PCV2在体内传播的途径之一。与DEX相比,VDEX促进猪脾淋巴细胞增殖的作用更强,说明VDEX可能是DC在PCV2感染中调节免疫反应的介质之一。与DEX中mi RNA相比,VDEX中表达差异显著的mi RNA可能是促进脾淋巴细胞增殖的效应物质之一。
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