组蛋白赖氨酸去甲基化酶5B（Histone Lysine Demethylase 5B,KDM5B）是含JmjC结构域的家族中的一员,主要去除组蛋白3第4位赖氨酸（H3K4）的三、二、一甲基化。H3K4me3是一个默认的基因转录激活标志,其表达量往往与靶基因的转录水平呈正相关性,KDM5B作为H3K4me3的去甲基化酶,暗示其具有一定的转录抑制作用。最近,一些研究发现,在胃癌组织中KDM5B表达量高于癌旁组织,KDM5B高表达可以降低H3K4me3修饰水平,与胃癌细胞的增殖、迁移以及肿瘤生长有促进作用。因此,KDM5B可能是一个潜在的癌症治疗靶点,开发它的高效抑制剂或许可以为癌症治疗提供新的策略。KDM5B的晶体结构表明JmjC结构域是它的活性催化中心,其去甲基化活性依赖于亚铁离子（Fe2+）和α-酮戊二酸（α-KG）等辅离子。目前KDM5B抑制剂的发现主要集中于优化与Fe2+或α-KG螯合的化合物的类似物以及天然产物的筛选。然而,螯合于Fe2+或α-KG的化合物往往对于JmjC家族其它成员也有抑制功能,导致此类抑制剂选择性较低。因此,发现新型抑制剂并对其进行结构优化有望开发KDM5B高选择性的抑制剂。另一方面,由于目前筛选KDM5B抑制剂的平台大多是使用纯化的重组蛋白评估小分子化合物的抑制活性,在进行进一步活性检测实验时,常遇到细胞通透性差等问题,使得KDM5B抑制剂难以进入临床研究。为此,建立基于细胞水平的高通量筛选KDM5B抑制剂方法为发现新型抑制剂以及先导抑制剂是很有必要的。本文中,我们对临床胃癌病人组织进行了免疫组化实验,结果表明,胃癌组织中KDM5B的表达量明显高于相应的癌旁组织,且具有显著性意义（p＜0.001）。对比TCGA数据库中胃癌肿瘤组织的KDM5B的表达量发现,胃癌组织中KDM5B表达量高于正常组织,与免疫组化结果一致。利用Kaplan Meier生存分析网站对KDM5B进行了分析,分析结果显示,其高表达患者的生存期明显低于低表达患者的生存期。我们猜想KDM5B在一定程度上参与了胃癌的调控,有望成为胃癌治疗靶点。针对目前KDM5B抑制剂的研究现状和高通量筛选过程中遇到的问题,我们建立了基于细胞水平高通量筛选KDM5B抑制剂的方法。首先,利用基因重组技术我们构建了 KDM5B的真核表达重组质粒,该质粒具有哺乳动物细胞系统启动子（CAG）,可以在哺乳动物细胞中表达。将KDM5B重组质粒转染到HEK-293T细胞中过表达KDM5B蛋白,结合免疫荧光染色和基于细胞的高内涵筛选（high content screening,HCS）技术,通过检测 KDM5B 底物 H3K4me3 的表达量变化,评价化合物对KDM5B的抑制作用。此筛选方法在96孔板进行,可用于高通量筛选。为优化筛选步骤,我们选择了荧光化合物花青素5（Cyanine5,Cy5）与KDM5B底物H3K4me3的抗体结合,获得了荧光标记一抗,可直接用于HCS分析。通过计算Zfactor评价该筛选系统的稳定性,Zfactor计算结果为0.677,说明筛选方法比较稳定,S/B值为1.479,说明筛选体系的阳性对照与阴性对照之间差异明显,可以高通量筛选KDM5B抑制剂。最后,使用该筛选方法评价化合物库中化合物对KDM5B去甲基化酶活性影响,发现了化合物1F12可以明显上调HEK-293T细胞内H3K4me3的表达量。该化合物可以用来进一步研究对KDM5B的抑制作用以及在胃癌细胞中的生物活性机制。综上,我们建立的基于细胞的高通量筛选KDM5B抑制剂方法,具有高通量、体积小、自动化、快速检测和准确定量等优点,为发现新型KDM5B抑制剂提供了新的思路和方法,对研究KDM5B抑制剂与癌症治疗具有较高的应用价值。